Giardia duodenum se yon òganis parazit ki lakòz giardiasis, yon enfeksyon entesten espesyalman komen nan jèn timoun ki gen siy klinik dyare.Nou te deja rapòte ke G. duodenalis ekstraselilè deklannche aktivasyon an nan entraselilè oligomerization-tankou reseptè 3 (NLRP3) obligatwa nukleotid ak kontwole repons enflamatwa lame atravè sekresyon vesik ekstraselilè (EV).Sepandan, modèl molekilè egzak nan EV duodenococcal ki asosye ak patojèn (GEV) ki enplike nan pwosesis sa a ak wòl NLRP3 inflammasome a nan giardiasis rete yo dwe elisid.
Plasmid ekspresyon ekaryotik recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 ak alfa-7.3 giardins nan GEV yo te konstwi, transfekte nan makrofaj peritoneal prensipal sourit, epi yo te detekte lè yo mezire molekil sib enflamasyon caspase-1 la.Yo te teste nivo ekspresyon p20 la..G. duodenalis alpha-2 ak alpha-7.3 giardines te orijinal idantifye pa mezire NLRP3 inflammasome (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 ak caspase-1 p20), sekresyon IL.Nivo 1β, nivo oligomerizasyon apoptotik takte pwoteyin (ASC), ak lokalizasyon imunofluoresan nan NLRP3 ak ASC.Lè sa a, wòl nan NLRP3 inflammasome nan patojèn nan G. duodenalis te evalye lè l sèvi avèk sourit nan ki deklanchman NLRP3 te bloke (NLRP3 bloke sourit) ak chanjman patolojik nan pwa kò, chaj parazit duodnal, ak tisi duodnal yo te kontwole.Anplis de sa, nou envestige si wi ou non hiardines alfa-2 ak alfa-7.3 pwovoke sekresyon IL-1β nan vivo atravè NLRP3 inflammasome a epi detèmine wòl nan molekil sa yo nan patojèn nan G. duodenalis nan sourit.
Alfa-2 ak alfa-7.3 giardines pwovoke aktivasyon NLRP3 inflammasome nan vitro.Sa a te mennen nan aktivasyon p20 caspase-1, yon ogmantasyon nan nivo ekspresyon de NLRP3, pro-IL-1β, ak pro-caspase-1 pwoteyin, yon ogmantasyon siyifikatif nan sekresyon IL-1β, fòmasyon nan tach ASA nan la. sitoplasm, ak endiksyon nan oligomerizasyon ASA.NLRP3 enflamasyon Pèt penil agrave patojèn nan G. duodenalis nan sourit.Sourit trete ak spor pa gavage soti nan NLRP3-bloke sourit ekspoze yon nimewo ogmante nan trofozoit ak gwo domaj nan villi yo duodnal, karakterize pa kript nekrotik ak ratresi ak branch.Eksperyans nan vivo yo te montre ke giardines alfa-2 ak alfa-7.3 ka pwovoke sekresyon IL-1β atravè inflammasome NLRP3, ak vaksinasyon ak giardines alfa-2 ak alfa-7.3 redwi patojèn nan G. duodenalis nan sourit.
Ansanm, rezilta etid sa a sijere ke giardia alfa-2 ak alfa-7.3 lakòz ogmantasyon nan enflamasyon lame NLRP3 epi redwi enfeksyon G. duodenalis nan sourit, ki se objektif pwomèt pou anpeche giardiasis.
Giardia duodenum se yon parazit pwotozoyan ekstraselilè ki ap viv nan ti trip la epi ki lakòz 280 milyon ka giardiasis ak dyare chak ane, espesyalman nan mitan jèn timoun nan peyi devlope yo [1].Moun yo vin enfekte lè yo bwè dlo oswa manje ki kontamine ak spor M. duodenum, ki answit antre nan vant la epi yo elimine nan ji gastric yo.Trofozoit Giardia duodenum tache ak epithelium duodnal la, sa ki lakòz kè plen, vomisman, dyare, doulè nan vant, ak pèdi pwa.Moun ki gen iminodefisyans ak fibwoz sistik yo sansib a enfeksyon.Enfeksyon ka rive tou nan fè sèks oral ak nan dèyè [2].Medikaman tankou metronidazol, tinidazol, ak nitazoxanide se opsyon tretman pi pito pou enfeksyon duodnal [3].Sepandan, dwòg chimyoterapi sa yo lakòz efè segondè negatif tankou kè plen, kanserojèn, ak jenotoksisite [4].Se poutèt sa, estrateji ki pi efikas yo bezwen devlope pou anpeche enfeksyon G. duodenalis.
Enflamasome yo se yon klas nan konplèks pwoteyin sitosol ki fè pati repons iminitè natirèl la, ki ede defann kont envazyon patojèn ak medyatè repons enflamatwa [5].Pami inflammasomes sa yo, nucleotide-binding oligomerization (NOD) reseptè 3 (NLRP3) nucleotide-binding oligomerization (NLRP3) nucleotide-binding-like inflammasome te etidye anpil paske li ka detekte pa divès kalite patojèn / domaj ki asosye modèl molekilè (PAMP/ DAMP), rekonèt, aktive sistèm iminitè natirèl la.ak kontwole omeyostazi entesten nan anpil maladi enflamatwa [6,7,8].Li konsiste de reseptè rekonesans modèl (PRR) NLRP3, yon adaptè pwoteyin takte apoptotik (ASC), ak yon efèktè procaspase-1 oswa procaspase-11.NLRP3 inflammasome aji kòm yon lame kont envazyon patojèn, jan yo obsève nan Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10], ak etid Leishmania.[11], men li te rapòte tou ke aktivasyon nan NLRP3 inflammasome limite repons iminitè pwoteksyon ak agrave pwogresyon maladi, pou egzanp, nan vè [12].Dapre rezilta anvan nou yo, nou rapòte ke G. duodenalis ekstraselilè deklannche deklanchman enflamasyon NLRP3 ak modil repons enflamatwa lame pa sekrete vesik ekstraselilè (EVs) [13].Sepandan, wòl nan NLRP3 inflammasome nan G. duodenalis enfeksyon nan vivo rete yo dwe detèmine.
Giardins yo te dekri orijinèlman kòm eleman estriktirèl nan sitoskelèt G. duodenalis epi jwe yon wòl enpòtan nan motilite trofozoit ak atachman selil epitelyal nan ti trip la.Pou pi byen adapte yo ak anviwònman an ak ogmante patojèn yo, G. duodenalis trofozoit devlope yon estrikti cytoskeletal inik ki gen ladan 8 flagèl, 1 kò presegondè, ak 1 disk ventral [14].Trofozoit yo nan Giardia duodenum sèvi ak cytoskeleton yo antre anwo ti trip la, espesyalman duodenum la, epi kole ak enterocytes.Yo toujou ap imigre epi kole ak selil epitelyal yo lè l sèvi avèk metabolis selilè.Se poutèt sa, gen yon relasyon sere ant sitoskelèt yo ak virulans.Giardines espesifik pou Giardia duodenum yo se eleman nan estrikti nan sitoskelèt [15] epi yo divize an kat klas: α-, β-, γ-, ak δ-giardines.Gen 21 manm nan fanmi an α-giardin, yo tout gen yon kapasite kalsyòm-depandan yo mare fosfolipid [16].Yo konekte tou sitoskelèt la ak manbràn selilè a.Nan moun ki gen dyare ki te koze pa G. duodenalis, α-giardin yo trè eksprime ak iminoreaktif pandan enfeksyon [17].Vaksen eterològ ki baze sou Giardia alfa-1 pwoteje kont giardiasis nan sourit epi yo se potansyèl antijèn kandida pou devlopman vaksen [18].Alpha-8 giardin, lokalize nan manbràn plasma ak flagèl, men se pa nan disk ventral la, amelyore mobilite ak to kwasans trofozoit nan G. duodenalis [19].Alpha-14 giardin tache ak estrikti mikrotubul sou flagèl epi li afekte viabilite G. duodenalis [20].Alpha-11 giardine prezan nan abondans pandan tout sik lavi a, ak twòp ekspresyon nan alfa-11 giardine domaje G. duodenalis tèt li [21].Sepandan, li pa klè si alfa-2 giardine ak alfa-7.3 giardine se pwoteksyon kont enfeksyon G. duodenalis ak mekanis kache yo.
Nan etid sa a, plasmid ekspresyon ekaryotik recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ak pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine yo te transfekte nan macrophages peritoneal prensipal sourit pou aktive lame NLRP3.Lè sa a, sib enflamasome yo te tès depistaj.Nou te evalye tou wòl NLRP3 inflammasome nan patojèn G. duodenalis, te envestige si alpha-2 ak alpha-7,3 giardines pwovoke deklanchman NLRP3 inflammasome nan vivo, epi detèmine ke de wòl sa yo nan giardines nan patojèn nan. G. duodenalis.Objektif komen nou an se te devlope objektif pwomèt pou prevansyon enfeksyon G. duodenalis.
Sovaj kalite (WT) C57BL/6 sourit fi ki gen laj 5-8 semèn yo te achte nan Liaoning Changsheng Eksperimantal Animal Center (Liaoning, Lachin).Sourit yo te gen aksè gratis nan dlo, yo te resevwa manje esterilize epi yo te kenbe nan yon sik limyè / fè nwa 12/12 èdtan.Anvan enfeksyon, sourit yo te resevwa antibyotik ad libitum nan dlo pou bwè ak anpisilin (1 mg/mL), vancomycin (1 mg/mL), ak neomicin (1.4 mg/mL) (tout achte nan Shanghai, Lachin, òganis atifisyèl) [22 ].].Sourit ki te pèdi kapasite pou yo manje ak bwè pou > 24 èdtan epi ki pèdi ≥ 20% pwa kò yo te imanite nan debwatman nan matris.
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, USA) te konplete ak 12.5% ​​serom fetal bovine (FBS; Chak Green, Zhejiang, Lachin) ak 0.1% kòlè bovine (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA). ).USA) nan kondisyon mikwo-aerobik.Trofozoit konfluyan yo te kolekte sou glas epi yo te pase nan yon rapò 1:4 pou plis repwodiksyon.
Giardia duodenum spor yo te pwovoke jan sa dekri deja [23], trofozoit yo te rekòlte nan faz logaritmik ak Lè sa a, dilye ak enkapsulasyon pwovoke mwayen, pH 7.1 (modifye TYI-S-33) nan yon konsantrasyon final nan 1 × 106 trofozoit / mL.konsantrasyon kòlè 0.05% mwayen).Trofozoit yo te kiltive nan kondisyon anaerobik nan 37 ° C jiskaske faz kwasans logaritmik la.Chanje mwayen an nan mwayen ki pwovoke sis (pH 7.8; modifye mwayen TYI-S-33 ak 1% konsantrasyon kòlè) ak kilti G. duodenalis nan 37 ° C pou 48-96 èdtan, pandan ki sis fòmasyon yo te obsève anba yon mikwoskòp.Apre pi fò nan trofozoit yo te pwovoke yo fòme spor, yo te rekòlte melanj kilti a epi yo te resispann nan dlo esteril deyonize pou lyse trofozoit ki rete yo.Sist yo te konte epi estoke nan 4 ° C pou analiz ki vin apre yo atravè yon tib gastric nan sourit.
Vezik ekstraselilè Giardia (GEV) yo te anrichi jan sa dekri deja [13].Trophozoites nan faz kwasans logaritmik yo te resuspende nan modifye TYI-S-33 mwayen ki te prepare ak exosome-apovri FBS (Endistri Byolojik, Beit-Haemek, Izrayèl) nan yon konsantrasyon final nan 1 × 106 parazit / mL ak enkube pou 12 èdtan.yo te izole nan surnatant kilti a pa santrifujasyon nan 2000 g pou 10 min, 10,000 g pou 45 min, ak 100,000 g pou 60 min.Precipitates te fonn nan phosphate tampon saline (PBS), quantifiée w ap itilize yon BCA protéines assay kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) Et sere nan -80° C. ou te itilize dirèkteman pou plis analiz.
Prensipal makrofaj peritoneal sourit yo te prepare jan sa dekri deja [24].Yon ti tan, sourit (ki gen laj 6-8 semèn) yo te sou fòm piki (intraperitoneally [ip]) ak 2.5 ml nan 2.98% Difco likid thioglycol mwayen (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) ak manje 3-4 palè.Yon sispansyon nan makrofaj yo te kolekte nan kavite nan vant nan sourit apre etanasya ak santrifuje 3 fwa nan 1000 g pou 10 min.Selil rekòlte yo te detekte pa sikometri koule lè l sèvi avèk makè CD11b la jiskaske pite selil yo te> 98%, Lè sa a, ajoute nan plak kilti selil 6-byen (4.5 x 106 selil / byen) ak enkubasyon ak 10% FBS (Bioindustry) nan 37 ° C.ak 5% CO2.
RNA te ekstrè soti nan 1 × 107 trofozoit nan 1 ml reyaktif TRIzol (Vazyme, Nanjing, Lachin), ADN jenomik te ekstrè soti nan total G. duodenalis RNA lè l sèvi avèk MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Lachin) ak ADN konplemantè (cDNA) te sentèz itilize MonScript RTIIII Super Mix (Monad) dapre enstriksyon manifakti a.
Enfòmasyon sou sekans CDS pou jèn G. duodenalis sib la te jwenn nan NCBI GenBank la.Sèvi ak Primer 5.0 pou desine yon premye klonaj san pwoblèm espesifik pou chak jèn sib.Jadendanfan an pi devan (5′-3′) konsiste de twa pati: yon sekans sipèpoze ak yon vektè linearize pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) epi kòmanse kodon ATG ak GNN (si premye baz la pa G).Sa a se fè amelyore efikasite nan ekspresyon an.Anplis de sa, omwen 16 bp konbine baz (kontni GC 40-60% / Tm apeprè 55 °C).Jadendanfan ranvèse a (5′-3′) konsiste de de pati, yon sekans sipèpoze ak yon vektè EcoRV-linearyze pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) ak yon baz konbine nan omwen 16 bp.(eksepte de dènye arè yo).baz) yon kodon tankou AA oswa GA pou pèmèt plasmid recombinant eksprime pwoteyin ki make yo).Sekans Jadendanfan yo ki nan lis nan Tablo 1 epi yo te sentèz pa Kangmet Biotechnology Co, Ltd (Changchun, Lachin).
Sib yo te anplifye lè l sèvi avèk Pfu ADN polymerase (Tiangen, Beijing, Lachin) oswa Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, Lachin) lè l sèvi avèk prepare G. duodenalis cDNA kòm yon modèl.Plasmid vektè ekspresyon ekaryotik pcDNA3.1(+) te linearize ak anzim restriksyon EcoRV ak defosforitasyon lè l sèvi avèk Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Linearized pcDNA3.1(+) fragman ak fragman anplifye jèn sib yo te pirifye lè l sèvi avèk yon twous pou pirifye jèl ADN (Tiangen) ak quantifye lè l sèvi avèk yon Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Fragman pcDNA3.1(+) la ak chak fragman jèn sib yo te rekòmanse lè l sèvi avèk MonClone yon sèl melanj klonaj asanble (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Lachin) ak konfime pa sekans ADN lè l sèvi avèk Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Lachin)..
Plasmid san Endotoxin pcDNA3.1(+)-alpha-2 ak pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 yo te pwodwi lè l sèvi avèk SanPrep Endotoxin-gratis Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).Konsantrasyon an te kenbe pi wo pase 500 ng/µl pou asire ke EDTA nan tanpon elisyon an pa t entèfere ak tès transfèksyon an.Prensipal makrofaj peritoneal sourit yo te kiltive nan plak 6-byen ak mwayen konplè RPMI 1640 (Endistri Byolojik) pou 12 èdtan, Lè sa a, selil yo te lave 3 fwa nan PBS cho pou retire penisilin ak streptomycin, ak Lè sa a, nan mwayen konplete ak mwayen konplè.Endotoxin-gratis plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 ak pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) yo te dilye nan 125 μl nan Opti-MEM redwi serom mwayen (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Lè sa a, 5 µl nan reyaktif transfèksyon Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) te dilye nan 125 µl nan medyòm Opti-MEM ki ba serom.Prepare konplèks lipozom-ADN pa melanje plasmid dilye endotoxin-gratis la ak Lipofectamine 2000 epi kite melanj lan kanpe nan tanperati chanm pou 5 minit.Transfere konplèks yo separeman nan selil nan chak pi epi melanje dousman.Apre 4 èdtan, yo te ranplase mwayen kilti selil la ak 2 ml mwayen konplè RPMI 1640 epi yo te kontinye kiltive pou 24 èdtan.Yo te ajoute mwayen kilti selil fre nan selil yo epi yo enkube pou plizyè pwen tan depann sou konsepsyon tès la.
Echantiyon pwoteyin ki soti nan supernatant ak lisat selil yo te prepare jan sa dekri anvan [25].Paramèt transfè manbràn pou pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-aktin, ak His-tag yo te 200 mA / 90 min.Pou interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Swis) ak NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Swis) ak 1:5000 vize etikèt li (Amylet Scientific, Wuhan, Lachin) ak β-aktin (Proteintech, Wuhan, Lachin).
Cross-linking ak disuccinimide suberate (DSS) te fèt jan sa dekri deja [26].Selil yo te lave 3 fwa ak PBS frèt epi yo te konplètman lysed ak yon zegwi kalib 27 nan 50 µl tanpon reyaksyon ASC (pH 8.0) ki gen 25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES ak 125 mM NaHCO3.Yo te santrifize melanj lan nan 5000 g pou 3 min epi yo te siture granules la ak 10 µl DSS (25 mM nan DMSO) ak 40 µl tanpon reyaksyon ASC pou 30 min nan 37 ° C.Apre santrifujasyon nan 5000 g pou 10 min, yo te fonn i grenn nan yon solisyon nan 40 µl nan tanpon reyaksyon ASC ak 10 µl nan 6x tanpon pwoteyin chaje (TransGen, Beijing, Lachin), ak Lè sa a, solisyon an te etenn nan tanperati chanm pou 15. min., Lè sa a, bouyi 10 minit.Lè sa a, echantiyon pwoteyin yo te sibi Western blotting lè l sèvi avèk antikò prensipal anti-ASC (Wanleibio, Shenyang, Lachin) nan yon rapò dilution nan 1:500.
Apre yon pwosedi ki deja dekri [13], yo te rekòlte supernatant kilti selil yo epi yo te detèmine sekresyon cytokine pro-enflamatwa IL-1β lè l sèvi avèk twous IL-1 Beta ELISA sourit la (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Konvèti valè OD450nm nan konsantrasyon pwoteyin lè l sèvi avèk koub estanda IL-1β.
Selil ki kouvwi sou kouvèti yo te lave dousman 3 fwa nan PBS cho, fikse nan fiksasyon selil tisi (Biosharp, Beijing, Lachin) pou 10 minit nan tanperati chanm (RT), nan 0.1% Triton X-Permeabilize nan 100 (dilye nan PBS; Biosharp). ) pou 20 minit nan tanperati chanm epi bloke nan 5% albumin serom bovin (nan PBS) pou 2 èdtan nan tanperati chanm.Lè sa a, selil yo te enkube lannwit lan nan 4 ° C ak antikò prensipal kont ASC (1:100 dilution) oswa NLRP3 (1:100 dilution), respektivman, ak Cy3 ki make bouk kabrit anti-lapen IgG (H + L) (1:400; EarthOx). , San Francisco, CA, USA) oswa FITC-konjige kabrit anti-sourit IgG (1:400; Earthox) lannwit lan nan 37 ° C nan fè nwa a pou 1 èdtan.Nwayo yo te tache ak Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Lachin) pou 5 minit epi yo te obsève anba yon mikwoskòp fliyoresan (Olympus Corporation, Tokyo, Japon).
Sourit yo te divize an kat gwoup (n = 7 nan chak gwoup): (i) PBS-trete gwoup kontwòl negatif (PBS sèlman; gavage 100 µl / sourit PBS ki te swiv pa piki chak jou entraperitoneal 100 µl / sourit PBS 3 èdtan pita)., kontinyèlman pou 7 jou);(ii) gwoup kontwòl negatif trete ak inibitè MCC950 [27] (100 µl / sourit atravè PBS gavage, 3 èdtan pita, 10 mg / kg pwa kò [BW] MCC950 [nan PBS] te administre intraperitoneally chak jou, dire 7 jou);(iii) Gwoup enfeksyon kyst G. duodenalis (1.5 x 106 spor / sourit pa gavage, 3 èdtan pita, 100 μl / sourit PBS intraperitoneally administre chak jou pou 7 jou);(iv) G. duodenalis kyst konbine gwoup enfeksyon MCC950 gwoup tretman inhibitor (1.5 × 106 spor / sourit atravè gavage, 10mg / kg pwa kò MCC950 intraperitoneally chak jou pou 7 jou nan 3h).Yo te kontwole pwa kò chak sourit chak jou epi yo te retire tout sourit nan 7yèm jou a.Duodenum rekòlte (3 cm nan longè) te koupe an ti moso nan 1 ml PBS, spor yo te detwi lannwit lan nan PBS nan 4 ° C, ak G. duodenalis trofozoit.Douodèn fre (1 cm nan longè) te izole pou ematoksilin ak eozin (H&E) tach.
Sourit yo te divize an de gwoup: (i) gwoup kontwòl MOCK ak (ii) gwoup inibitè MCC950.Te gen senk tretman nan chak gwoup (n = 7/gwoup tretman): (i) PBS tretman gwoup kontwòl negatif (PBS sèlman; 100 µl / sourit PBS, entramuscular (IM) piki (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) gwoup kontwòl negatif plasmid pcDNA3.1(+) (100 µg/ADN sourit, atravè piki nan miskilè) (iii) G. duodenalis kyst enfeksyon gwoup kontwòl pozitif (1.5 x 106 kys/sourit, via gavage) (iv) a); gwoup trete ak plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/ADN sourit, pa piki nan miskilè), epi (v) yon gwoup trete ak plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 µg/sourit). ADN, apre 12 èdtan nan pasaj, sourit nan gwoup inibitè MCC950 la te resevwa yon piki entraperitoneal chak jou nan MCC950 (10 mg / kg pwa kò) pou 7 jou, pandan y ap sourit nan gwoup MOCK la te resevwa yon volim egal nan tretman PBS. Echantiyon san yo te. yo te kolekte nan sourit je yo epi kite yo lannwit lan nan 4 °C echantiyon serom yo te izole lè l sèvi avèk tès imunosorban ki lye ak anzim (ELISA) pou ak mezi nivo IL-1β.
Trant-senk sourit yo te divize an senk gwoup (n = 7 / gwoup).Gwoup 1 se te yon gwoup kontwòl negatif trete ak PBS: sourit yo te resevwa 100 μl PBS nan miskilè ak 3 jou pita pa gavage.Gwoup 2 se yon gwoup kontwòl pozitif ki enfekte ak spor G. duodenalis: sourit yo te sou fòm piki ak 100 μl PBS, ak 3 jou pita 1.5 x 106 spor / sourit yo te enjekte entragastrik.Twazyèm gwoup - vaksinasyon plasmid ak pcDNA3.1(+) an konbinezon ak yon gwoup kontwòl pou enfeksyon sist duodnal: sourit te resevwa 100 μg plasmid DNA pcDNA3.1(+)(im) oralman, 1.5×106 spor/sourit 3 pou plizyè jou.Gwoup 4 ak 5 yo te recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine plasmid oswa pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine plasmid an konbinezon ak enfeksyon sist G. duodenalis.Gwoup eksperimantal: sourit yo te resevwa 100 µg pcDNA3.1(+)-giardine plasmid DNA (im), Lè sa a, 3 jou pita, 1.5 × 106 spor / sourit yo te sou fòm piki atravè gavage.Yo te kontwole pwa kò chak sourit apre entwodiksyon G. duodenalis kyst la atravè tib la.Duodèn fre yo te kolekte pou mezi chaj parazit ak analiz HE tach.
Chanjman istopatolojik yo te analize dapre yon pwosedi ki te pibliye deja [30].Duodenum fre te fikse ak fiksasyon selil tisi, entegre nan parafine, koupe an seksyon 4 μm, tache ak H & E epi analize anba yon mikwoskòp limyè.Yon patolojis pa okouran de tretman an te evalye chanjman reprezantatif patolojik nan sèt seksyon tisi ki soti nan sèt sourit endepandan epi yo te kaptire nan agrandisman 200x.Longè villi yo ak pwofondè kript yo te mezire an akò ak metòd yo dekri deja.
Rezilta yo nan vitro ak nan vivo yo te jwenn an triple.Grafik yo te pwodwi lè l sèvi avèk GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Diferans ant de gwoup yo te analize pa t-tès, pandan y ap diferans ki genyen ant ≥3 gwoup yo te analize pa yon sèl-fason analiz divèjans (ANOVA) lè l sèvi avèk lojisyèl SPSS (vèsyon 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Done yo te analize pou omojeneite nan divèjans lè l sèvi avèk tès Levene a ki te swiv pa tès post hoc Bonferroni a (B).Siyifikasyon eksprime kòm P<0.05, P<0.01, ak P<0.001 (pa enpòtan [ns]) (P>0.05).
Analiz anvan nou an nan pwoteomik GEV nan ansiklopedi Kyoto nan jèn ak jenom (KEGG) te montre ke anpil objektif ka patisipe nan aktivasyon an nan chemen siyal enflamatwa [13].Nou te chwazi de sib pwomèt, alfa-2 ak alfa-7.3 giardins, anplifye molekil sa yo epi sèvi ak yo pou konstwi vektè ekspresyon ekaryotik pcDNA3.1(+).Apre sekans, yo te transfekte plasmid ekspresyon recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 ak alfa-7.3 giardine nan macrophages peritoneal sourit prensipal yo, epi yo te idantifye pwoteyin siyati caspase-1 p20 nan enflamasyon (yon fragman kaspase-1 aktive). kòm klè molekil kle ki ka deklanche enflamasyon.Rezilta yo te montre ke alfa-2 ak alfa-7.3 giardines ka pwovoke p20 caspase-1 ekspresyon menm jan ak GEV.Pa gen okenn efè sou aktivasyon caspase-1 yo te jwenn nan kontwòl negatif ki pa trete (PBS sèlman) ak kontwòl plasmid pcDNA3.1 (+) (Figi 1).
Mezi p20 caspase-1 aktivasyon pa pcDNA3.1(+)-alpha-2 ak alpha-7.3 giardins.Plasmid ekspresyon ekaryotik recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 ak alfa-7.3 giardines (pi wo pase chak liy) te transfekte nan makrofaj peritoneal sourit prensipal yo ak supernatant kilti yo te rekòlte 24 èdtan pita.Western blotting te itilize pou mezire nivo ekspresyon pwoteyin enflamasome caspase-1 p20 siyati a.Gwoup tretman PBS-sèlman (liy C) ak gwoup monoterapi pcDNA3.1(+) (liy pcDNA3.1) yo te itilize kòm yon kontwòl negatif, epi yo te itilize gwoup tretman GEV kòm yon kontwòl pozitif.Ekspresyon pwoteyin recombinant la te konfime pa detekte yon tag histidine nan chak pwoteyin, ak gwoup pwoteyin espere yo te alfa-2 giardine (38.2 kDa) ak alfa-7.3 giardine (37.2 kDa).GEV, vesik ekstraselilè Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), vektè EcoRV-linearize, SUP, supernatant
Pou detèmine si alfa-2 giardine ak alfa-7.3 giardine pwovoke p20 caspase-1 ekspresyon epi jwe yon wòl nan aktive repons enflamatwa NLRP3 lame a, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ak pcDNA3.1(+)-alpha. -7.3 giardin te transfekte nan macrophages prensipal sourit peritoneal ak ADN plasmid recombinant, ak nivo ekspresyon, lokalizasyon, ak oligomerizasyon nan pwoteyin kle enflamatwa NLRP3 yo te detèmine.Nan eksperyans sa a, GEV te itilize kòm gwoup kontwòl pozitif, ak gwoup pa gen okenn tretman (PBS sèlman) oswa gwoup tretman transfeksyon pcDNA3.1(+) te gwoup negatif la.Rezilta yo te montre ke, tankou nan gwoup GEV, ADN plasmid recombinant nan giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 ak giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 te lakòz upregulation nan NLRP3, pro-IL-1β ak procaspase-1 ak kaspase-1 aktivasyon (figi 2a).Anplis de sa, tou de giardines pwovoke siyifikatif sekresyon IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alfa-2 giardine: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alfa-7.3 giardine: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P <0.0001;GEV: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (Figi 2b).Pifò pwoteyin ASC yo te monomerik nan gwoup ki pa gen tretman an oswa nan gwoup tretman an transfekte ak plasmid pcDNA3.1(+), kontrèman ak pcDNA3.1(+)-alpha-2 oswa pcDNA3.1(+)-alpha- 7.3 giardine.Oligomerizasyon ASC te fèt nan ADN plasmid recombinant nan gwoup oswa gwoup kontwòl pozitif GEV, ki montre yon fòm oligomerik (Figi 2c).Done preliminè sa yo sijere ke alfa-2 giardine ak alfa-7,3 giardine ka pwovoke deklanchman enflamasyon NLRP3.Etid imunofluoresan ki vin apre nan lokalizasyon ASC ak NLRP3 te montre ke nan gwoup kontwòl negatif la, pwoteyin ASC te gaye nan tout sitoplasm la epi li te parèt kòm yon siyal pwen sou eksitasyon pcDNA3.1(+)-alpha-2 ak giardine oswa pcDNA3.1(+)-alfa-7,3 gwoup giardine oswa GEV gwoup kontwòl pozitif (Figi 2d).Nan gwoup pcDNA 3.1 ki te trete ak kontwòl negatif ak plasmid, siyal pwoteyin NLRP3 pa te detekte, pandan y ap yon pwen siyal fliyoresan an repons a pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine oswa pcDNA3.1(+)-alpha-7.3. te detekte..giardine yo jwenn nan sitoplasm la oswa sou eksitasyon HEV la (Fig. 2e).Done sa yo plis demontre ke G. duodenalis giardin alfa-2 ak giardin alfa-7.3 aktive NLRP3 inflammasome nan macrophages peritoneal prensipal sourit.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin ak pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin aktive NLRP3 inflammasome nan macrophages peritoneal sourit.Transfekte plasmid ekspresyon ekaryotik recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin ak pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin nan makwofaj ak selil prensipal peritoneal murin, oswa rekòlte supernatant la nan lespas 24 èdtan pou analiz ekspresyon, oligomerizasyon. , sekresyon.ak lokalizasyon kle pwoteyin enflamatwa.Gwoup PBS-sèlman (C) ak gwoup tretman sèl pcDNA3.1(+) yo te itilize kòm kontwòl negatif, epi yo te itilize gwoup tretman GEV kòm gwoup pozitif.a Pwoteyin enflamatwa kle NLRP3, ki gen ladan NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1, ak p20 caspase-1, te detekte pa Western blotting.b Yo te detèmine nivo sekresyon IL-1β nan supernatant yo lè l sèvi avèk tès imunosorban ki lye ak anzim (ELISA).Diferans ant gwoup kontwòl ak eksperimantal yo te analize pa yon sèl-fason analiz divèjans (ANOVA) lè l sèvi avèk SPSS lojisyèl vèsyon 22.0.Asteris yo endike diferans enpòtan ant gwoup **P<0.01 ak ***P<0.001.c Nivo oligomerization ASC nan granules yo te detèmine pa DSS cross-linking analiz, pandan y ap nivo ASC nan lysates selil yo te itilize kòm yon kontwòl loading.d Vizyalizasyon lokalizasyon ISC lè l sèvi avèk imunofluoresans.e Immunofluorescence te itilize pou visualiser localisation de NLRP3.ASC, pwoteyin apoptotik tankou speck;IL, entèleukin;NLRP3, reseptè 3 ki tankou oligomerization-obligatwa;ns, pa enpòtan (P > 0.05)
Tou de G. duodenalis ak GEVs li sekrete aktive NLRP3 inflammasome ak kontwole repons enflamatwa lame an vitro.Kidonk, wòl nan NLRP3 inflammasome nan patojèn nan G. duodenalis rete klè.Pou mennen ankèt sou pwoblèm sa a, nou te fèt yon eksperyans ant sourit ki enfekte ak G. duodenalis kyst ak sourit ki enfekte ak G. duodenalis kyst + MCC950 inibitè tretman ak konpare ekspresyon NLRP3 inflammasome lè enfekte ak G. duodenalis kyst.Yon konplo detaye nan eksperyans la montre nan Fig. 3a.Chanjman nan pwa kò sourit nan diferan gwoup tretman yo te kontwole pou 7 jou apre enfeksyon ak spor, ak rezilta yo montre nan Fig. 3b.Konpare ak gwoup la trete ak PBS pi, rezilta yo te montre ke (i) pwa kò sourit ki enfekte ak G. duodenalis sist diminye soti nan jou 3 a jou 7 apre enfeksyon;(ii) tretman ak inibitè MCC950 pa te gen okenn efè enpòtan sou pwa kò sourit yo..Konpare ak gwoup enfeksyon sèl la, BW nan gwoup enfeksyon duodnal trete ak MCC950 diminye nan diferan degre (Jou 1: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; Jou 2: ANOVA, F (3, 24). ) = 0,4602, P<0,0001 Jou 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010 Jou 4: ANOVA, F (3, 24) = 1,683, P = 0,0052, F (3, 24)=0.6497, P=0.0645; Jou 6: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175; Jou 7: ANOVA, F(3, 24) = 2.893;Done sa yo demontre ke NLRP3 inflammasome la pwoteje sourit kont pèdi pwa enpòtan nan premye etap yo (2-4 jou) nan enfeksyon duodnal.Lè sa a, nou vize detekte G. duodenalis trofozoit nan likid lavaj duodnal ak rezilta yo montre nan Figi 3c.Konpare ak gwoup enfeksyon sist G. duodenalis la, kantite trofozoit nan duodenum ogmante siyifikativman apre bloke NLRP3 inflammasome (t (12) = 2.902, P = 0.0133).Tisi duodnal tache ak HE te montre, konpare ak kontwòl negatif trete ak PBS ak MCC950 pou kont li: ​​(i) G. duodenalis enfeksyon sist te lakòz domaj nan villi duodnal yo (ANOVA, F (3, 24) = 0.4903, P = 0.0488 ) ak atrofi kript (ANOVA, F (3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) duodenum soti nan sourit ki enfekte ak G. duodenalis spor ak trete ak inibitè MCC950.villi duodnal yo te domaje ak mouri (ANOVA, F (3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) ak atrofi ak branch kript (ANOVA, F (3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- f) .Rezilta sa yo sijere ke NLRP3 inflammasome a jwe yon wòl nan diminye patojèn nan G. duodenalis.
Wòl NLRP3 inflammasome nan enfeksyon Giardia duodenum.Sourit yo te gavaged (iv) ak spor duodenococcal ak Lè sa a, trete avèk oswa san MCC950 (ip).Gwoup tretman sèl ak PBS oswa MCC950 yo te itilize kòm kontwòl.Gwoup eksperimantal ak rejim tretman.b Yo te kontwole pwa kò sourit nan chak gwoup tretman pandan 7 jou.Diferans ki genyen ant gwoup enfeksyon G. duodenalis ak gwoup tretman enfeksyon G. duodenalis + MCC950 te analize pa t-tès lè l sèvi avèk vèsyon lojisyèl SPSS 22.0.Asteris yo endike diferans enpòtan nan *P<0.05, **P<0.01, oswa ***P<0.001.c Chaj parazit yo te detèmine pa konte kantite trofozoit nan likid lavaj duodnal.Diferans ki genyen ant gwoup enfeksyon G. duodenalis ak gwoup tretman enfeksyon G. duodenalis + MCC950 te analize pa t-tès lè l sèvi avèk vèsyon lojisyèl SPSS 22.0.Asterisk endike diferans enpòtan nan *P <0.05.d Ematoksilin ak eozin (H&E) rezilta tach nan istopatoloji duodnal.Flèch wouj yo endike domaj nan villi yo, flèch vèt yo endike domaj nan kript yo.Ba echèl: 100 µm.e, f Analiz estatistik wotè villus duodnal ak wotè kript sourit.Asteris yo endike diferans enpòtan nan *P<0.05 ak **P<0.01.Rezilta yo pran nan 7 eksperyans byolojik endepandan.BW, pwa kò;ig, wout livrezon intragastric;ip, wout livrezon intraperitoneal;ns, pa enpòtan (P> 0.05);PBS, saline tampon fosfat;WT, kalite sovaj
Sekresyon IL-1β se yon karakteristik deklanchman enflamasyon.Pou detèmine si G. duodenalis alpha-2 giardine ak alpha-7.3 giardine aktive NLRP3 lame inflammasome nan vivo, nou te itilize sourit WT ki pa trete (gwoup sham) ak NLRP3 inflammasome-bloke sourit (MCC950 inibit gwoup tretman).Yon konplo detaye eksperyans nan montre nan Fig. 4a.Gwoup eksperimantal fèt nan sourit trete ak PBS, G. duodenalis kyst tretman pa gavage, piki nan miskilè pcDNA3.1, ak piki nan miskilè nan pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine oswa pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.Nan 7yèm jou a apre administrasyon nan miskilè plasmid recombinant la, yo te kolekte serom epi yo te detèmine nivo IL-1β nan chak gwoup.Jan yo montre nan Figi 4b, nan gwoup MOCK a: (i) konpare ak gwoup PBS a, tretman pcDNA3.1 pa te gen okenn efè enpòtan sou sekresyon IL-1β (ANOVA, F (4.29) = 4.062, P = 0.9998), sepandan, Sekresyon IL-β te siyifikativman elve nan gwoup sist G. duodenalis (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine ak pcDNA3.1- Piki nan miskilè alfa-7.3 giardine siyifikativman ogmante nivo serik IL-1β (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine pwovoke nivo segondè nan sekresyon IL -1β nan gwoup piki nan miskilè pcDNA3.1-alpha-2 giardine (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .Konpare ak chak gwoup nan gwoup tretman MCC950 ak gwoup MOCK: (i) nivo sekresyon IL-1β nan gwoup kontwòl PBS ak gwoup kontwòl pcDNA3.1 diminye nan yon sèten mezi apre bloke inhibiteur MCC950, men diferans lan pa t. enpòtan (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) apre bloke MCC950., sekresyon IL-1β te siyifikativman redwi nan gwoup ki enfekte G. duodenalis, gwoup giardine pcDNA3.1-alpha-2, ak gwoup giardine pcDNA3.1-alpha-7.3 (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3.540, P = 0.0120 pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.0447 pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F (9, 58). ) = 3.540, P = 0.0164).Rezilta sa yo sijere ke alfa-2 giardine ak alfa-7.3 giardine medyatè aktivasyon nan NLRP3 inflammasome nan vivo.
pcDNA3.1(+)-giardines aktive inflammasome lame NLRP3 nan vivo.Sourit yo te iminize (IM) ak plasmid ekspresyon ekaryotik recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine oswa pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine epi yo te trete ak MCC950 (ip; gwoup MCC950) oswa ou pa (gwoup enbesil). ).PBS oswa pcDNA3.1(+) gwoup tretman plasmid la te itilize kòm yon kontwòl negatif, gwoup tretman G. duodenalis te itilize kòm yon kontwòl pozitif.Gwoup eksperimantal ak rejim tretman.b Nivo serik IL-1β nan sourit yo te mezire nan jou 7 pa tès ELISA.Diferans ant gwoup nan gwoup MOCK yo te analize lè l sèvi avèk yon sèl-fason ANOVA, ak diferans ki genyen ant gwoup la MOCK ak gwoup la MCC950 yo te analize lè l sèvi avèk t-tès la nan vèsyon lojisyèl SPSS 22.0.Asteris yo endike diferans enpòtan ant gwoup tretman nan gwoup MOCK la, *P<0.05 ak ***P<0.001;siy dola ($) endike diferans enpòtan ant chak gwoup nan gwoup MOCK ak gwoup MCC950 nan P<0.05.Rezilta sèt eksperyans byolojik endepandan.mwen, piki nan miskilè, ns, pa enpòtan (P> 0.05)
Pou mennen ankèt sou efè alfa-2 ak alfa-7.3 giardine-medyatè aktivasyon nan inflammasome lame NLRP3 la sou G. duodenalis enfeksyon, nou te itilize sourit WT C57BL / 6 ak enjekte alfa-2 giardine ak alfa-7.3 giardine.yo te enjekte plasmid la nan miskilè, apre 3 jou nan tib gastric G. duodenalis sist la, apre sa yo te obsève sourit yo pou 7 jou.Yon konplo detaye eksperyans nan montre nan Fig. 5a.Chak jou chak jou te mezire pwa kò chak sourit, yo te kolekte echantiyon tisi fre duodnal nan 7yèm jou apre yo fin administre yo nan yon tib gastric, yo te mezire kantite trofozoit, epi yo te obsève chanjman istopatolojik yo.Jan yo montre nan Figi 5b, ak ogmante tan manje, BW nan sourit nan chak gwoup ogmante piti piti.MT nan sourit yo te kòmanse diminye sou 3yèm jou apre administrasyon entragastric G. duodenalis spor, ak Lè sa a, piti piti ogmante.Aktivasyon nan NLRP3 inflammasome pwovoke pa piki nan miskilè nan alpha-2 giardine ak alpha7.3 giardine siyifikativman atenue pèdi pwa nan sourit (Jou 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 1.399, P = 0.9754 Jou 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0.9987 Jou 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; Jou 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.3172, P = 0.8409 Jou 3: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA; 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 Jou 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4 , 30) = 0.8222, P = 0.0083 Jou 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA , F (4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, Jou 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.5620, P <0.0001, Jou 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 Jou 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 Jou 6: pcDNA3 .1 - alfa-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, Jou 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;Jou 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 Jou 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0.0001).Chaj parazit la te evalye nan duodenum la (figi 5c).Konpare ak kontwòl pozitif ki pa trete a ak gwoup la sou fòm piki ak vektè pcDNA3.1 vid la, kantite trofozoit G. duodenalis te siyifikativman redwi nan gwoup yo te enjekte ak α-2 giardine ak α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha). -2 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P <0.0001).Anplis de sa, giardine alfa-7.3 te plis pwoteksyon nan sourit pase giardine alfa-2 (ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0081).Rezilta tach HE yo montre nan fig.5d–f.Sourit yo te enjekte ak alfa-2 giardine ak alfa-7.3 giardine te gen mwens blesi tisi duodnal, ki manifeste pa domaj villus, konpare ak sourit yo te enjekte ak G. duodenalis ak sourit yo te enjekte ak G. duodenalis an konbinezon ak yon vektè pcDNA3 vid .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 2.466, P = 0.0035 oswa P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 2.466, P = 0.0028 oswa P = 0.0055) ak redwi atrofi kript (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 1.470, P = 0.0264 oswa P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA , F(3, 24) = 1.470, P = 0.0371 oswa P = 0.0191).Rezilta sa yo sijere ke alfa-2 giardine ak alfa-7,3 giardine diminye enfeksyon G. duodenalis pa aktive NLRP3 inflammasome nan vivo.
Wòl pcDNA3.1(+)-giardins nan enfeksyon G. duodenalis.Sourit yo te iminize (IM) ak plasmid ekspresyon ekaryotik recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine oswa pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ak Lè sa a, defye ak G. duodenalis spor (ig).Gwoup PBS la ak pcDNA3.1(+) + gwoup tretman sis duodnal yo te itilize kòm gwoup kontwòl negatif, e gwoup tretman sis duodnal yo te itilize kòm gwoup kontwòl pozitif.Gwoup eksperimantal ak rejim tretman.b Yo te kontwole MT sourit nan chak gwoup tretman pou 7 jou apre defi.Asteris yo endike diferans enpòtan ant gwoup nan gwoup G. duodenalis ak gwoup pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine, *P <0.05, **P <0.01, ak ***P <0.001;siy dola a ($) endike yon diferans enpòtan ant chak gwoup G. duodenalis ak gwoup pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine, $$P<0.01 ak $$$P<0.001.c Chaj parazit yo te detèmine pa konte kantite trofozoit nan 1 ml lavaj duodnal ki soti nan duodenum (3 cm nan longè) epi eksprime kòm kantite parazit pou chak cm nan duodenum.Diferans ant gwoup enfeksyon G. duodenalis, gwoup giardine pcDNA3.1(+)-alpha-2, ak gwoup giardine pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 yo te analize pa yon fason ANOVA lè l sèvi avèk vèsyon lojisyèl SPSS 22.0.Asteris yo endike diferans enpòtan nan **P<0.01 ak ***P<0.001.d Chanjman istopatolojik nan duodenum la.Flèch wouj yo endike domaj nan villi yo, flèch vèt yo endike domaj nan kript yo.Ba echèl: 100 µm.e, f Analiz estatistik wotè villus duodnal sourit (e) ak wotè kript (f).Diferans ant gwoup yo nan Figi 1d yo te analize pa yon sèl-fason ANOVA lè l sèvi avèk SPSS lojisyèl vèsyon 22.0.Asteris yo endike diferans enpòtan nan *P<0.05 ak **P<0.01.Rezilta sèt eksperyans byolojik endepandan.ns, pa enpòtan (P > 0.05)
Giardia duodenum se yon parazit entesten byen koni moun ak lòt mamifè ki lakòz giardiasis.An 2004, li te enkli nan Inisyativ Maladi Neglije OMS la akòz gwo prévalence li sou 6 ane, espesyalman nan kominote ki gen yon sitiyasyon sosyoekonomik ki ba [32].Sistèm iminitè natirèl la jwe yon wòl enpòtan nan repons iminitè a nan enfeksyon G. duodenalis.Yo te rapòte makwofaj sourit yo anglouti ak touye G. duodenalis lè yo lage pyèj ekstraselilè [33].Etid anvan nou yo te montre ke G. duodenalis, yon parazit ekstraselilè ki pa pwogrese, aktive p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, ak NLRP3 chemen siyal enflamatwa nan makrofaj sourit kontwole repons enflamatwa lame, ak lage GEV ka amelyore pwosesis sa a.13], 24].Sepandan, PAMP yo egzak ki enplike nan enflamasyon NLRP3 inflammasome-reglemante nan GEV ak wòl nan NLRP3 inflammasome nan giardiasis rete yo dwe klè.Pou fè limyè sou de kesyon sa yo, nou te fè etid sa a.
NLRP3 inflammasome a sitiye nan sitoplasm selil iminitè a epi li ka aktive pa divès patikil tankou kristal asid urik, toksin, bakteri, viris, ak parazit.Nan etid bakteri, toksin yo te idantifye kòm PAMP kle ki aktive detèktè enflamatwa, ki mennen nan enflamasyon ak lanmò selil [34].Gen kèk toksin estriktirèl divès, tankou hemolysin soti nan Staphylococcus aureus [35] ak Escherichia coli [36], hemolysin BL (HBL) ki soti nan enterotoxin (NHE) [37], pwovoke aktivasyon an nan enflamasyon NLRP3.Etid viral yo te montre ke pwoteyin virulans tankou SARS-COV-2 anvlòp (E) pwoteyin [38] ak Zika viris NS5 pwoteyin [39] se PAMP enpòtan ki rekonèt pa reseptè NLRP3 la.Nan etid parazit, anpil parazit yo te rapòte ke yo asosye ak aktivasyon inflammasome lame, tankou Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41], ak Leishmania [42].Pwoteyin granules dans GRA35, GRA42, ak GRA43, ki asosye ak virulans Toxoplasma gondii, nesesè pou endiksyon piroptoz nan makrofaj rat Lewis [43].Anplis de sa, kèk etid Leishmania te konsantre sou molekil endividyèl ki enplike nan NLRP3 inflammasome a, tankou parazit manbràn lipofosfoglikan [44] oswa metaloproteaz zenk [45].Pami fanmi jèn alfa-giardin ki sanble ak anexin yo, yo montre ke alpha-1 giardin se yon kandida potansyèl pou vaksen ki bay pwoteksyon kont G. duodenalis nan yon modèl sourit [18].Nan etid nou an, nou chwazi G. duodenalis faktè virulans alfa-2 ak alfa-7,3 giardin, ki inik nan giardia men relativman mwens rapòte.De jèn sib sa yo te klonaj nan vektè sistèm ekspresyon ekaryotik pcDNA3.1(+) pou analiz deklanchman enflamasyon.
Nan modèl sourit nou an, fragman kaspas clivé sèvi kòm makè deklanchman enflamatwa.Apre eksitasyon, NLRP3 reyaji ak ASC, rekrite procaspases, epi jenere kaspas aktif ki fende pro-IL-1β ak pro-IL-18 nan IL-1β ki gen matirite ak IL-18, respektivman -18.Caspases enflamatwa (caspases-1, -4, -5 ak -11) se yon fanmi konsève nan proteaz sistein ki enpòtan pou defans natirèl epi ki enplike nan enflamasyon ak lanmò selil pwograme [46].Caspase-1 aktive pa inflammasomes kanonik [47], pandan y ap kaspas-4, -5, ak -11 koupe pandan fòmasyon inflammasome atipik [48].Nan etid sa a, nou te itilize makrofaj peritoneal sourit kòm yon modèl ak envestige p20 caspase-1 cleaved caspase-1 kòm yon makè nan aktivasyon enflamasyon lame NLRP3 nan syans nan G. duodenalis enfeksyon.Rezilta yo te montre ke anpil alfa-giardin yo responsab pou deklanchman tipik nan enflamasyon, ki se ki konsistan avèk dekouvèt la nan molekil virulans kle ki enplike nan bakteri ak viris.Sepandan, etid nou an se sèlman yon ekran preliminè e gen lòt molekil ki ka aktive inflammasomes ki pa klasik, kòm etid anvan nou an te jwenn tou de inflammasomes klasik ak ki pa klasik nan enfeksyon G. duodenalis [13].Pou detèmine si wi ou non p20 caspase-1 ki pwodui ki asosye ak inflammasome NLRP3 a, nou transfekte alpha-2 ak alpha-7.3 giardin nan makrofaj peritoneal sourit pou detèmine nivo ekspresyon pwoteyin molekil kle yo ak nivo oligomerizasyon ASC, ki konfime ke tou de α-giardin aktive. enflamasome NLRP3.Rezilta nou yo yon ti kras diferan de sa yo ki nan Manko-Prykhoda et al., ki te rapòte ke eksitasyon nan selil Caco-2 ak G. muris oswa E. coli EPEC tansyon pou kont li ka ogmante entansite fluoresans nan NLRP3, ASC, ak caspase-1, byenke pa siyifikativman, pandan y ap ki jan costimulation nan G. muris ak E. coli ogmante nivo yo nan twa pwoteyin [49].Diferans sa a ka akòz diferans ki genyen nan seleksyon an nan espès Giardia, liy selil yo, ak selil prensipal yo.Nou menm tou nou te fè tès nan vivo lè l sèvi avèk MCC950 nan sourit fi WT C57BL / 6 ki gen 5 semèn, ki gen plis sansib a G. duodenalis.MCC950 se yon inibitè ti molekil NLRP3 ki pisan ak selektif ki bloke aktivasyon NLRP3 kanonik ak ki pa kanonik nan konsantrasyon nanomolar.MCC950 inibit aktivasyon NLRP3 men li pa afekte deklanchman AIM2, NLRC4, ak NLRP1 chemen enflamatwa oswa chemen siyal TLR [27].MCC950 bloke aktivasyon NLRP3 men li pa anpeche inisyasyon NLRP3, K + eflu, Ca2 + foul, oswa entèraksyon ki genyen ant NLRP3 ak ASC;olye de sa, li anpeche deklanchman NLRP3 inflammasome pa bloke ASC oligomerization [27].Se poutèt sa, nou itilize MCC950 nan yon etid in vivo pou detèmine wòl inflammasome NLRP3 apre piki giardine.Aktive caspase-1 p10 cleaves pro-enflamatwa cytokines pro-IL-1β ak pro-IL-18 nan IL-1β ki gen matirite ak IL-18 [50].Nan etid sa a, nivo serik IL-1β nan sourit ki trete giardine avèk oswa san MCC950 yo te itilize kòm yon endikatè pou konnen si NLRP3 inflammasome la te aktive.Kòm espere, tretman MCC950 siyifikativman redwi serik IL-1β nivo.Done sa yo montre klèman ke G. duodenalis giardin alfa-2 ak giardin alfa-7.3 kapab aktive inflammasome sourit NLRP3 la.
Done enpòtan ki akimile nan dènye deseni ki sot pase yo te demontre ke IL-17A se regilatè mèt iminite kont G. muris, pwovoke IL-17RA siyal, pwodui peptides antimikwòb, ak reglemante aktivasyon konpleman [51].Sepandan, enfeksyon Giardia rive pi souvan nan jèn adilt yo, epi li te rapòte ke enfeksyon Giardia nan sourit jèn pa aktive repons IL-17A pou egzèse efè pwoteksyon li yo [52], sa ki pouse chèchè yo chèche lòt Giardia imunomodulateur.mekanis enfeksyon helminth.Otè yo nan yon etid resan rapòte ke G. muris ka aktive NLRP3 inflammasome pa E. coli EPEC, ki ankouraje pwodiksyon an nan peptides antimikwòb ak diminye kapasite atachman li yo ak kantite trofozoit nan aparèy la entesten, kidonk diminye gravite a nan kolon. maladi ki te koze pa bacilli [49].Enflamasome NLRP3 patisipe nan devlopman divès maladi.Etid yo montre ke Pseudomonas aeruginosa deklannche otofaji nan makrofaj pou evite lanmò selil, e pwosesis sa a depann de aktivasyon NLRP3 inflammasome [53].Pou N. caninum, deklanchman NLRP3 inflammasome nan espès oksijèn ki reyaktif medyatè limite replikasyon li nan lame a, fè li yon potansyèl sib terapetik [9].Yo te jwenn Paracoccidioides brasiliensis pou pwovoke deklanchman NLRP3 inflammasome nan selil dendritik ki sòti nan mwèl zo sourit, sa ki lakòz liberasyon cytokine enflamatwa IL-1β, ki jwe yon wòl enpòtan nan defans lame [10].Plizyè espès Leishmania, ki gen ladan L. amazonensis, L. major, L. braziliensis, ak L. infantum chagasi, aktive NLRP3 ak ASC-depandan caspase-1 nan makrofaj, osi byen ke enfeksyon Leishmania.Replikasyon parazit amelyore nan sourit ki manke nan jèn NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Zamboni et al.Yo rapòte enfeksyon Leishmania pou pwovoke deklanchman NLRP3 inflammasome nan macrophages, ki limite replikasyon parazit intraselilè.Kidonk, Leishmania ka anpeche aktivasyon NLRP3 kòm yon estrateji evite.Nan etid in vivo, NLRP3 inflammasome kontribye nan eliminasyon Leishmania, men li pa afekte tisi [54].Okontrè, nan etid helminthiasis, aktivasyon NLRP3 inflammasome siprime iminite pwoteksyon lame a kont helminthiasis gastwoentestinal [12].Shigella se youn nan bakteri prensipal ki lakòz dyare atravè lemond.Bakteri sa yo ka pwovoke IL-1β pwodiksyon atravè reseptè P2X7 K + eflux, espès oksijèn reyaktif, asidifikasyon lizozomal, ak domaj mitokondriyo.Enflamasome NLRP3 la kontwole negatif fagositoz ak aktivite bakterisid nan makrofaj kont Shigella [55].Etid Plasmodium yo te montre ke sourit AIM2, NLRP3 oswa caspase-1 ki enfekte ak Plasmodium pwodwi nivo segondè nan entèferon tip 1 epi yo pi rezistan a Plasmodium enfeksyon [56].Sepandan, wòl alfa-2 giardine ak alfa-7.3 giardine nan pwovoke deklanchman patojèn nan enflamasyon NLRP3 nan sourit pa klè.
Nan etid sa a, anpèchman NLRP3 inflammasome pa MCC950 redwi BW ak ogmante kantite trofozoit nan likid lavaj entesten nan sourit, sa ki lakòz chanjman patolojik ki pi grav nan tisi duodnal.Alpha-2 giardine ak alfa-7.3 giardine aktive sourit lame NLRP3 inflammasome, ogmante pwa kò sourit, redwi kantite trofozoit nan likid lavaj entesten, ak soulaje blesi patolojik duodnal.Rezilta sa yo sijere ke G. duodenalis ka aktive inflammasome lame NLRP3 atravè alfa-2 giardine ak alfa-7,3 giardine, diminye patojèn nan G. duodenalis nan sourit.
Ansanm, rezilta nou yo demontre ke alfa-2 ak alfa-7.3 giardines pwovoke deklanchman NLRP3 lame inflammasome la epi redwi enfeksyon G. duodenalis nan sourit yo.Se poutèt sa, molekil sa yo se objektif pwomèt pou prevansyon giardaz.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: yon BECA.Li te fèk revele ke Pat Inflamm fè alèji ak dwòg.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: yon revizyon nan famakoterapi.Opinyon ekspè nan yon famasyen.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, rezistans dwòg ak dekouvèt nouvo objektif.Enfekte maladi dwòg sib.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, elatriye NLRP3 inflammasome ak maladi enflamatwa.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Wòl inflammasome a nan enflamasyon entesten ak kansè.Gastroenteroloji.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Aktivasyon inflammasome kanonik ak atipik NLRP3 nan kafou tolerans iminitè ak enflamasyon zantray.pre-iminitè.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.ROS-medyatè NLRP3 inflammasome aktivasyon patisipe nan repons a enfeksyon N. caninum.Vektè parazit.2020;13:449.