Mèsi paske w vizite Nature.com.Vèsyon navigatè w ap itilize a gen sipò CSS limite.Pou pi bon eksperyans, nou rekòmande pou w sèvi ak yon navigatè ki ajou (oswa enfim mòd konpatibilite nan Internet Explorer).Antretan, pou asire sipò kontinye, nou pral rann sit la san estil ak JavaScript.
Toxoplasma gondii se yon parazit pwotozoan entraselilè ki modile mikro-anviwònman lame ki enfekte a epi li konnen yo asosye ak ensidans kwasans timè nan sèvo a.Nan etid sa a, nou sipoze ke exosomal miRNA-21 ki soti nan enfeksyon Toxoplasma ankouraje kwasans timè nan sèvo.Yo te karakterize eksozòm ki soti nan microglia BV2 ki enfekte ak Toxoplasma epi yo te konfime entènalizasyon selil gliom U87.Yo te analize pwofil ekspresyon microRNA exosomal lè l sèvi avèk etalaj microRNA ak microRNA-21A-5p ki asosye ak Toxoplasma gondii ak klasman timè.Nou menm tou nou te envestige nivo mRNA nan jèn timè ki asosye nan selil gliom U87 pa chanje nivo miR-21 nan exosomes ak efè exosomes sou pwopagasyon selil U87 gliom imen.Nan exosomes nan selil gliom U87 ki enfekte ak Toxoplasma gondii, ekspresyon microRNA-21 ogmante epi aktivite jèn antitumor (FoxO1, PTEN, ak PDCD4) redwi.Exosomes BV2-derive ki enfekte ak Toxoplasma pwovoke pwopagasyon selil gliom U87.Exosomes pwovoke kwasans selil U87 nan yon modèl timè sourit.Nou sijere ke ogmante exosomal miR-21 nan microglia BV2 ki enfekte ak Toxoplasma ka jwe yon wòl enpòtan kòm yon pwomotè kwasans selil nan selil gliom U87 pa downregulating jèn antitumor.
Yo estime ke plis pase 18.1 milyon ka kansè avanse yo te dyagnostike atravè lemond nan 2018, ak apeprè 297,000 timè sistèm nève santral yo te dyagnostike chak ane (1.6% nan tout timè)1.Rechèch anvan yo te montre ke faktè risk pou devlope timè nan sèvo imen gen ladan divès kalite pwodwi chimik, istwa fanmi, ak radyasyon iyonize ki soti nan ekipman terapetik ak dyagnostik tèt.Sepandan, kòz egzak maladi sa yo pa konnen.Apeprè 20% nan tout kansè atravè lemond yo koze pa ajan enfektye, ki gen ladan viris, bakteri ak parazit3,4.Patojèn enfektye deranje mekanis jenetik selil lame a, tankou reparasyon ADN ak sik selil la, epi yo ka mennen nan enflamasyon kwonik ak domaj nan sistèm iminitè a5.
Ajan enfektye ki asosye ak kansè imen yo se patojèn viral ki pi komen, tankou papillomavirus imen ak viris epatit B ak C.Parazit ka jwe tou yon wòl potansyèl nan devlopman kansè imen.Plizyè espès parazit, sètadi Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis ak Hymenolepis nana, yo te enplike nan divès kalite kansè imen 6,7,8.
Toxoplasma gondii se yon pwotozoan entraselilè ki kontwole mikro-anviwònman selil lame ki enfekte yo.Yo estime parazit sa a enfekte apeprè 30% nan popilasyon mondyal la, ki mete tout popilasyon an nan risk9,10.Toxoplasma gondii ka enfekte ògàn vital yo, ki gen ladan sistèm nève santral la (SNC), epi lakòz maladi grav tankou menenjit fatal ak ansefalit, espesyalman nan pasyan iminitè yo9.Sepandan, Toxoplasma gondii kapab tou chanje anviwònman an nan lame ki enfekte a lè yo modile kwasans selil ak repons iminitè nan moun iminokonpetan, ki mennen ale nan antretyen nan yon enfeksyon kwonik asymptomatik9,11.Enteresan, bay korelasyon ki genyen ant prévalence T. gondii ak ensidans timè nan sèvo, kèk rapò sijere ke chanjman nan anviwònman an lame nan vivo akòz enfeksyon kwonik T. gondii sanble ak mikro anviwònman timè a.
Exosomes yo konnen kòm kominikatè entèselilè ki bay kontni byolojik, ki gen ladan pwoteyin ak asid nikleyik, ki soti nan selil vwazen16,17.Exosomes ka enfliyanse pwosesis byolojik ki gen rapò ak timè tankou anti-apoptoz, anjyogenesis, ak metastaz nan mikroanvironman timè a.An patikilye, miRNAs (miRNAs), ti RNA ki pa kode apeprè 22 nukleotid nan longè, se regilatè jèn enpòtan pòs-transcriptional ki kontwole plis pase 30% mRNA imen atravè konplèks silansman miRNA-induced (miRISC).Toxoplasma gondii ka deranje pwosesis byolojik lè li kontwole ekspresyon miRNA nan lame ki enfekte yo.MiRNAs lame yo genyen siyal enpòtan pou kontwole pwosesis byolojik lame pou reyalize estrateji siviv parazit la.Kidonk, etidye chanjman nan pwofil miRNA lame a lè enfeksyon ak T. gondii ka ede nou konprann entèraksyon ki genyen ant lame a ak T. gondii pi klè.Vreman vre, Thirugnanam et al.15 sigjere ke T. gondii fè pwomosyon kanserojèn nan sèvo pa chanje ekspresyon li sou miRNA lame espesifik ki asosye ak kwasans timè epi li te jwenn ke T. gondii ka lakòz glioma nan bèt eksperimantal.
Etid sa a konsantre sou chanjman nan exosomal miR-21 nan microglia lame ki enfekte ak Toxoplasma BV2.Nou te obsève yon wòl posib nan miR-21 eksosomal ki chanje nan kwasans selil gliom U87 akòz retansyon nan nwayo FoxO1/p27, ki se sib miR-21 overexpressed.
Egzosom ki sòti nan BV2 yo te jwenn lè l sèvi avèk santrifujasyon diferans ak valide pa divès metòd pou anpeche kontaminasyon ak eleman selilè oswa lòt vesik.Elektwoforèz jèl SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) te montre modèl diferan ant pwoteyin ki sòti nan selil BV2 ak exosomes (Figi 1A), ak echantiyon yo te evalye pou prezans Alix, ki te analize pa Western blotting nan makè pwoteyin eksosomal nan.Yo te jwenn etikèt Alix nan pwoteyin exosome men se pa nan pwoteyin selil BV2 lisat (figi 1B).Anplis de sa, yo te analize RNA pirifye ki soti nan exosomes ki sòti nan BV2 lè l sèvi avèk yon bioanalyzer.18S ak 28S ribosomal yo te raman obsève nan modèl migrasyon RNA exosomal, ki endike pite serye (Figi 1C).Finalman, mikwoskòp elèktron transmisyon te montre ke ekzosom yo obsève yo te apeprè 60-150 nm nan gwosè e li te gen yon estrikti ki sanble ak tas tipik nan mòfoloji exosome (Fig. 1D).
Karakterizasyon exosomes ki sòti nan selil BV2.(A) Paj fèy done sekirite.Pwoteyin yo te izole nan selil BV2 oswa exosomes ki sòti nan BV2.Modèl pwoteyin yo diferan ant selil ak exosomes.(B) analiz Western blot nan yon makè ekzosomal (Alix).(C) Evalyasyon RNA pirifye ki soti nan selil BV2 ak exosomes ki sòti nan BV2 lè l sèvi avèk yon bioanalyzer.Kidonk, 18S ak 28S ribosomal subinite nan selil BV2 yo te raman jwenn nan RNA exosomal.(D) Mikwoskopi elektwonik transmisyon te montre ke exosomes izole nan selil BV2 yo te tache negatif ak 2% acetate uranyl.Egzosom yo apeprè 60-150 nm nan gwosè ak ki gen fòm tas (Song ak Jung, done ki pa pibliye).
Yo te obsève entèrnalizasyon selilè nan exosomes ki sòti nan BV2 nan selil gliom imen U87 lè l sèvi avèk mikwoskopi konfokal.Exosomes ki make PKH26 yo lokalize nan sitoplasm selil U87 yo.Nwayo yo te tache ak DAPI (Fig. 2A), ki endike ke exosomes ki sòti nan BV2 yo ka entènalize pa selil lame ak enfliyanse anviwònman an nan selil benefisyè yo.
Entènasyon nan exosomes ki sòti BV2 nan selil gliyom U87 ak exosomes ki sòti nan BV2 ki enfekte ak Toxoplasma RH pwovoke pwopagasyon selil gliom U87.(A) Egzozòm yo vale pa selil U87 yo mezire pa mikwoskopi konfokal.Selil gliom U87 yo te enkube ak exosomes ki make ak PKH26 (wouj) oswa san kontwòl pou 24 èdtan.Nwayo yo te tache ak DAPI (ble) ak Lè sa a, obsève anba yon mikwoskòp konfokal (ba echèl: 10 μm, x 3000).(B) U87 glioma selil pwopagasyon te detèmine pa tès pwopagasyon selil.Selil gliom U87 yo te trete ak exosomes pou tan ki endike a. *P <0.05 te jwenn nan tès t Elèv la. *P <0.05 te jwenn nan tès t Elèv la. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P <0.05 pa tès t Elèv la. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P <0.05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 jwenn lè l sèvi avèk tès t Student la.
Apre nou fin konfime entènalizasyon exosomes ki sòti nan BV2 nan selil gliom U87, nou te fè tès pwopagasyon selil pou mennen ankèt sou wòl exosomes ki sòti nan Toxoplasma ki sòti nan BV2 nan devlopman selil gliom imen.Tretman nan selil U87 ak exosomes ki soti nan selil BV2 T. gondii ki enfekte te montre ke exosomes ki sòti nan BV2 ki enfekte ak T. gondii te lakòz pwopagasyon siyifikativman pi wo nan selil U87 konpare ak kontwòl (Fig. 2B).
Anplis de sa, kwasans selil U118 te gen menm rezilta ak U87, paske Toxoplasma ankouraje exosomes te lakòz pi wo nivo pwopagasyon (done yo pa montre).Dapre done sa yo, nou ka endike ke exosomes ki enfekte ak Toxoplasma ki sòti nan BV2 jwe yon wòl enpòtan nan pwopagasyon selil gliom.
Pou mennen ankèt sou efè Toxoplasma ki enfekte BV2 ki sòti nan devlopman timè, nou te enjekte selil gliom U87 nan sourit toutouni pou yon modèl ksenograft epi nou te enjekte exosomes ki sòti nan BV2 oswa ki enfekte RH ki enfekte exosomes ki sòti nan BV2.Apre timè yo te vin parèt aparan apre 1 semèn, yo te divize chak gwoup eksperimantal 5 sourit dapre gwosè timè pou detèmine menm pwen an kòmanse, epi yo te mezire gwosè timè pou 22 jou.
Nan sourit ak modèl xenograft U87, yo te obsève gwosè timè ak pwa siyifikativman pi gwo nan gwoup exosome RH ki enfekte ak BV2 ki sòti nan jou 22 (Fig. 3A, B).Nan lòt men an, pa te gen okenn diferans enpòtan nan gwosè timè ant gwoup BV2 ki sòti nan exosome ak gwoup kontwòl la apre tretman exosome.Anplis de sa, sourit sou fòm piki ak selil gliom ak exosomes vizyèlman parèt pi gwo volim timè nan gwoup RH-enfekte BV2-derive exosomes (figi 3C).Rezilta sa yo demontre ke exosomes ki enfekte ak Toxoplasma ki sòti nan BV2 pwovoke kwasans gliom nan yon modèl timè sourit.
Onkogenesis (AC) nan exosomes ki sòti nan BV2 nan yon modèl sourit xenograft U87.Gwosè timè (A) ak pwa (B) te ogmante siyifikativman nan BALB/c sourit toutouni trete ak exosomes RH ki enfekte ki sòti nan BV2.BALB/c sourit toutouni (C) yo te enjekte anba lar ak 1 x 107 selil U87 sispann nan melanj Matrigel.Sis jou apre piki, yo te trete 100 μg exosomes ki sòti nan BV2 nan sourit yo.Gwosè ak pwa timè yo te mezire nan jou ki endike yo ak apre sakrifis, respektivman. *P <0.05. *P <0.05. *Р < 0,05. *P <0.05. *P <0.05. *P <0.05. *Р < 0,05. *P <0.05.
Done yo te montre ke 37 miRNAs (16 overexpressed ak 21 downexpressed) ki asosye ak iminite oswa devlopman timè yo te siyifikativman chanje nan microglia apre enfeksyon ak souch Toxoplasma RH la (Fig. 4A).Nivo ekspresyon relatif miR-21 nan mitan miRNA ki chanje yo te konfime pa RT-PCR an tan reyèl nan exosomes ki sòti nan BV2, exosomes trete ak selil BV2 ak U87.Ekspresyon miR-21 te montre yon ogmantasyon siyifikatif nan exosomes nan selil BV2 ki enfekte ak Toxoplasma gondii (souch RH) (Fig. 4B).Nivo ekspresyon relatif miR-21 nan selil BV2 ak U87 ogmante apre absorption nan exosomes ki chanje (Fig. 4B).Nivo relatif yo nan ekspresyon miR-21 nan tisi yo nan sèvo pasyan timè ak sourit ki enfekte ak Toxoplasma gondii (souch ME49) yo te pi wo pase nan kontwòl, respektivman (Fig. 4C).Rezilta sa yo gen rapò ak diferans ki genyen ant nivo ekspresyon microRNAs prevwa ak konfime nan vitro ak nan vivo.
Chanjman nan ekspresyon eksosomal miP-21a-5p nan mikroglia ki enfekte ak Toxoplasma gondii (RH).(A) Demontre chanjman enpòtan nan siRNA ki asosye ak iminite oswa devlopman timè apre enfeksyon T. gondii RH.(B) Nivo ekspresyon relatif miR-21 yo te detekte pa RT-PCR an tan reyèl nan exosomes ki sòti nan BV2, exosomes trete BV2, ak selil U87.(C) Nivo ekspresyon relatif miR-21 yo te jwenn nan tisi sèvo pasyan timè yo (N = 3) ak sourit ki enfekte ak Toxoplasma gondii (souch ME49) (N = 3). *P <0.05 te jwenn nan tès t Elèv la. *P <0.05 te jwenn nan tès t Elèv la. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0.05 yo te jwenn lè l sèvi avèk tès t Student la. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P <0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 jwenn lè l sèvi avèk tès t Student la.
Exosomes ki soti nan selil BV2 RH ki enfekte yo te mennen nan kwasans gliom nan vivo ak nan vitro (figi 2, 3).Pou detekte mRNA ki enpòtan, nou egzamine nivo mRNA nan jèn sib antitumor, bwat forkhead O1 (FoxO1), PTEN, ak lanmò selil pwograme 4 (PDCD4) nan selil U87 ki enfekte ak exosomes ki sòti nan BV2 oswa RH BV2.Analiz byoenfòmatik te montre ke plizyè jèn ki asosye ak timè, ki gen ladan jèn FoxO1, PTEN, ak PDCD4, gen sit obligatwa miR-2121,22.Nivo mRNA nan jèn sib antitumor yo te redwi nan exosomes ki sòti nan BV2 ki enfekte ak RH konpare ak exosomes ki sòti nan BV2 (Fig. 5A).FoxO1 te montre nivo pwoteyin redwi nan exosomes ki sòti nan BV2 ki enfekte ak RH konpare ak exosomes ki sòti nan BV2 (Figi 5B).Dapre rezilta sa yo, nou ta ka konfime ke exosomes ki sòti nan BV2 ki enfekte RH diminye jèn anti-onkojenik, kenbe wòl yo nan kwasans timè.
Toxoplasma RH-enfekte BV2-deriv exosomes pwovoke repwesyon nan jèn antitumor nan selil gliom U87 pa Toxoplasma RH-enfekte BV2-derive exosomes.(A) PCR an tan reyèl nan ekspresyon FoxO1, PTEN ak PDCD4 nan exosomes ki sòti nan T. gondii RH-enfekte BV2 konpare ak exosomes PBS.β-aktin mRNA te itilize kòm yon kontwòl.(B) Ekspresyon FoxO1 te detèmine pa Western blotting ak done densitometri yo te estatistik evalye lè l sèvi avèk pwogram ImageJ la. *P <0.05 te jwenn nan tès t Elèv la. *P <0.05 te jwenn nan tès t Elèv la. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0.05 yo te jwenn lè l sèvi avèk tès t Student la. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P <0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 jwenn lè l sèvi avèk tès t Student la.
Pou konprann efè miP-21 nan exosomes sou règleman jèn ki asosye ak timè yo, selil U87 yo te transfekte ak yon inibitè miP-21 lè l sèvi avèk Lipofectamine 2000 epi selil yo te rekòlte 24 èdtan apre transfèksyon.Nivo ekspresyon FoxO1 ak p27 nan selil transfekte ak inibitè miR-21 yo te konpare ak selil trete ak exosomes ki sòti nan BV2 lè l sèvi avèk qRT-PCR (Fig. 6A, B).Transfè inibitè miR-21 a nan selil U87 te siyifikativman downregulated ekspresyon FoxO1 ak p27 (FIG. 6).
RH-enfekte eksosomal BV2-derived miP-21 chanje ekspresyon FoxO1 / p27 nan selil gliom U87.Selil U87 yo te transfekte ak inibitè miP-21 lè l sèvi avèk Lipofectamine 2000 ak selil yo te rekòlte 24 èdtan apre transfeksyon.Nivo ekspresyon FoxO1 ak p27 nan selil transfekte ak inibitè miR-21 yo te konpare ak nivo nan selil trete ak exosomes ki sòti nan BV2 lè l sèvi avèk qRT-PCR (A, B).
Pou chape anba repons iminitè lame a, parazit Toxoplasma a transfòme nan yon sis tisi.Yo parazite divès tisi, ki gen ladan sèvo a, kè, ak misk skelèt, pandan tout lavi lame a epi yo modile repons iminitè lame a.Anplis de sa, yo ka kontwole sik selilè a ak apoptoz nan selil lame yo, ankouraje pwopagasyon yo14,24.Toxoplasma gondii prensipalman enfekte selil dendritik lame yo, netrofil, ak monosit / makrofaj, ki gen ladan mikroglia nan sèvo.Toxoplasma gondii pwovoke diferansyasyon nan makrofaj nan fenotip M2, afekte geri blesi apre enfeksyon patojèn, epi li asosye tou ak hypervascularization ak fibwoz granulomatoz.Patojèn konpòtman sa a nan enfeksyon Toxoplasma ka gen rapò ak makè ki asosye ak devlopman timè.Anviwònman ostil reglemante pa Toxoplasma ka sanble ak prekansè ki koresponn lan.Se poutèt sa, li ka sipoze ke enfeksyon Toxoplasma ta dwe kontribye nan devlopman nan timè nan sèvo.An reyalite, gwo pousantaj enfeksyon Toxoplasma yo te rapòte nan serom pasyan ki gen divès kalite timè nan sèvo.Anplis de sa, Toxoplasma gondii ka yon lòt efèktè kanserojèn ak aji sinèrjetik pou ede lòt kanserojèn ki bay enfeksyon devlope timè nan sèvo.Nan sans sa a, li vo anyen ke P. falciparum ak viris Epstein-Barr sinèrjetik kontribye nan fòmasyon nan lenfom Burkitt la.
Yo te envestige anpil wòl exosomes kòm regilatè nan domèn rechèch kansè.Sepandan, wòl nan exosomes ant parazit ak lame ki enfekte rete mal konprann.Jiskaprezan, regilatè divès kalite, ki gen ladan pwoteyin sekrete, te eksplike pwosesis byolojik pa ki parazit protozoan reziste atak lame ak perpétuer enfeksyon.Dènyèman, te gen yon konsèp k ap grandi ki mikwovesikul ki asosye ak pwotozoan ak microRNA yo kominike avèk selil lame yo pou kreye yon anviwònman favorab pou siviv yo.Se poutèt sa, plis etid yo bezwen dekouvri relasyon ki genyen ant miRNA eksosomal ki chanje ak pwopagasyon selil gliom.MikroRNA chanjman (jenn gwoup miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 ak miR-17-92) mare ak pwomotè STAT3 nan makrofaj moun ki enfekte ak toxoplasm, se reglemante epi pwovoke anti. -apoptoz an repons a enfeksyon Toxoplasma gondii 29 .Enfeksyon Toxoplasma ogmante ekspresyon de miR-17-5p ak miR-106b-5p, ki asosye ak plizyè maladi hyperproliferative 30 .Done sa yo sijere ke miRNAs lame reglemante pa enfeksyon Toxoplasma yo se molekil enpòtan pou siviv parazit ak patojèn nan konpòtman byolojik lame.
MiRNAs ki chanje yo ka enfliyanse divès kalite konpòtman pandan inisyasyon ak pwogresyon selil malfezan yo, ki gen ladan gliom: oto-sifizans nan siyal kwasans, ensansibilite nan siyal ki anpeche kwasans, evazyon apoptoz, potansyèl replikasyon san limit, anjyogenesis, envazyon ak metastaz, ak enflamasyon.Nan gliòm, yo te idantifye miRNA ki chanje nan plizyè etid profilage ekspresyon.
Nan etid la prezan, nou konfime nivo segondè nan ekspresyon miRNA-21 nan selil lame ki enfekte ak toxoplasma.MiR-21 te idantifye kòm youn nan microRNAs ki pi souvan overexpressed nan timè solid, ki gen ladan gliom, 33 ak ekspresyon li korelasyon ak klas la nan gliom.Prèv akimile sijere ke miR-21 se yon onkogen roman ki aji kòm yon faktè anti-apoptotik nan kwasans gliyom epi li trè eksprime nan tisi ak plasma nan maladi nan sèvo imen.Enteresan, inaktivasyon miR-21 nan selil gliom ak tisi deklanche anpèchman pwopagasyon selil akòz apoptoz ki depann de caspase.Analiz bioenfòmatik miR-21 prevwa objektif yo te revele plizyè jèn timè ki asosye ak chemen apoptoz, ki gen ladan lanmò selil pwograme 4 (PDCD4), tropomyosin (TPM1), PTEN, ak bwat forkhead O1 (FoxO1), ak sit obligatwa miR-2121 la..22.38.
FoxO1, kòm youn nan faktè transkripsyon yo (FoxO), patisipe nan devlopman divès kalite kansè imen epi li ka kontwole ekspresyon jèn timè tankou p21, p27, Bim ak FasL40.FoxO1 ka mare ak aktive inibitè sik selil tankou p27 pou siprime kwasans selil.Anplis, FoxO1 se yon efèktè kle nan siyal PI3K / Akt epi li kontwole anpil pwosesis byolojik tankou pwogresyon sik selil ak diferansyasyon selil atravè aktivasyon transcription p2742.
An konklizyon, nou kwè ke exosomal miR-21 ki sòti nan microglia ki enfekte ak Toxoplasma ka jwe yon wòl enpòtan kòm yon regilatè kwasans nan selil gliom (figi 7).Sepandan, plis etid yo bezwen jwenn yon lyen dirèk ant exosomal miR-21, chanje enfeksyon Toxoplasma, ak kwasans gliyom.Rezilta sa yo espere bay yon pwen depa pou etidye relasyon ki genyen ant enfeksyon Toxoplasma ak ensidans gliyom.
Yon dyagram chema nan mekanis gliyom (sèvo) kansè pwopoze nan etid sa a.Otè a trase nan PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Tout pwotokòl eksperimantal nan etid sa a, ki gen ladan itilizasyon bèt yo, te an akò ak Gid Etik Estanda Komite Itilizatè ak Swen Animal Seoul National University e yo te apwouve pa Komisyon Konsèy Revizyon Enstitisyonèl Lekòl Medsin Seoul National University (IRB nimewo SNU-). 150715).-2).Tout pwosedi eksperimantal yo te fèt an akò ak rekòmandasyon ARRIVE.
BV2 sourit microglia ak U87 selil gliom imen yo te kiltive nan Dulbecco a modifye Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Kore di) ak Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), respektivman, yo chak gen 10% serom fetis bovin, 4 mM l- glutamin, 0.2 mM penisilin ak 0.05 mM streptomycin.Selil yo te kiltive nan yon enkibatè ak 5% CO2 nan 37 ° C.Yo te itilize yon lòt liy selil gliom, U118, pou konparezon ak selil U87.
Pou izole exosomes soti nan T. gondii-enfekte RH ak ME49 tansyon, T. gondii tachyzoites (RH souch) yo te rekòlte nan kavite nan vant sourit BALB/c 6-semèn ki te enjekte 3-4 jou anvan.Tachyzoites yo te lave twa fwa ak PBS ak pirifye pa santrifujasyon nan 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Pou jwenn tachyzoites souch ME49, sourit BALB/c yo te enjekte intraperitoneally ak 20 spor tisi ak transfòmasyon tachyzoite nan spor te kolekte pa lave kavite nan vant sou 6-8yèm jou apre enfeksyon (PI).Sourit ki enfekte ak PBS.ME49 tachyzoites te grandi nan selil complétée ak 100 μg / ml penisilin (Gibco / BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg / ml streptomycin (Gibco / BRL), ak 5% serom fetis bovin (Lonza, Walkersville, MD) .., USA) nan 37 °C ak 5% gaz kabonik.Apre kiltivasyon nan selil Vero, tachyzoit ME49 yo te pase de fwa nan yon zegwi kalib 25 epi answit nan yon filtè 5 µm pou retire debri ak selil yo.Apre lave, tachyzoit yo te resuspende nan PBS44.Sist tisi nan souch Toxoplasma gondii ME49 yo te konsève pa piki intraperitoneal nan spor izole nan sèvo a nan sourit C57BL/6 enfekte (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Kore di).Sèvo sourit ki enfekte ME49 yo te rekòlte apre 3 mwa PI ak mens anba yon mikwoskòp pou izole spor.Sourit ki enfekte yo te kenbe nan kondisyon espesyal san patojèn (SPF) nan Seoul National University School of Medicine.
Total RNA te extrait de exosomes BV2-dérivés, BV2 cellules Et tissus itilize miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Almay) selon enstriksyon manifakti a, ki enkli tan enkubasyon pou etap elisyon an.Yo te detèmine konsantrasyon RNA a sou yon espektrofotomèt NanoDrop 2000.Yo te evalye kalite RNA microarrays lè l sèvi avèk yon bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Netherlands).
DMEM ak 10% exosome-poor FBS te prepare pa ultracentrifugasyon nan 100,000g pou 16 èdtan nan 4 ° C epi filtre atravè yon filtè 0.22 µm (Nalgene, Rochester, NY, USA).Selil BV2, 5 × 105, yo te kiltive nan DMEM ki gen 10% exosome-apovri FBS ak 1% antibyotik nan 37 ° C ak 5% CO2.Apre 24 èdtan nan enkubasyon, tachyzoites souch RH oswa ME49 (MOI = 10) yo te ajoute nan selil yo ak parazit ki pa anvayi yo te retire nan yon èdtan epi ranpli ak DMEM.Exosomes nan selil BV2 yo te izole pa modifye santrifujasyon diferans, metòd ki pi lajman itilize.Repoze granules exosome nan 300 µl PBS pou analiz RNA oswa pwoteyin.Konsantrasyon ekzosom izole yo te detèmine lè l sèvi avèk yon twous tès pwoteyin BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) ak yon espektrofotomèt NanoDrop 2000.
Precipitate ki soti nan selil BV2 oswa exosomes ki sòti nan BV2 yo te lysed nan solisyon ekstraksyon pwoteyin PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Kore di) ak pwoteyin yo te chaje sou Coomassie briyan ble tache 10% jèl poliakrilamid SDS.Anplis de sa, pwoteyin yo te transfere nan manbràn PVDF pou 2 èdtan.Western blots yo te valide lè l sèvi avèk antikò Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) kòm yon makè exosomal.HRP-konjige kabrit anti-sourit IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) ak yon analizeur imaj LAS-1000 plis luminesan (Fuji fotografi fim, Tokyo, Japon) yo te itilize kòm yon antikò segondè..Yo te fè mikwoskopi elèktron transmisyon pou etidye gwosè ak mòfoloji ekzosom yo.Exosomes izole nan selil BV2 (6.40 µg/µl) yo te prepare sou may ki kouvri ak kabòn ak negatif tache ak 2% acetate uranyl pou 1 min.Yo te obsève echantiyon yo prepare nan yon vòltaj akselere nan 80 kV lè l sèvi avèk yon JEOL 1200-EX II (Tokyo, Japon) ekipe ak yon kamera ES1000W Erlangshen CCD (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
Yo te tache ekzosom ki sòti nan BV2 lè l sèvi avèk PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) pou 15 minit nan tanperati chanm.Selil U87, 2 × 105, ak exosomes ki gen etikèt PKH26 (wouj) oswa ki pa gen okenn exosomes kòm yon kontwòl negatif, yo te enkube a 37 ° C pou 24 èdtan nan yon enkibatè 5% CO2.Nwayo selil U87 yo te tache ak DAPI (ble), selil U87 yo te fiks nan 4% paraformaldehyde pou 15 min nan 4 ° C ak Lè sa a, analize nan yon Leica TCS SP8 STED CW sistèm mikwoskòp konfokal (Leica Microsystems, Mannheim, Almay).obsèvab.
cDNA te sentèz soti nan siRNA lè l sèvi avèk Mir-X siRNA premye sentèz strand ak twous SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Japon).Yo te fè PCR an tan reyèl lè l sèvi avèk sistèm deteksyon PCR an tan reyèl iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) lè l sèvi avèk primè ak modèl melanje ak SYBR Premix.ADN te anplifye pou 40 sik denaturasyon nan 95 ° C pou 15 s ak annealing nan 60 ° C pou 60 s.Done ki soti nan chak reyaksyon PCR yo te analize lè l sèvi avèk modil analiz done lojisyèl sistèm optik iQ™5 (Bio-Rad).Chanjman relatif nan ekspresyon jèn ant jèn sib chwazi ak β-aktin/siRNA (ak U6) yo te kalkile lè l sèvi avèk metòd koub estanda a.Sekans premye yo itilize yo montre nan Tablo 1.
3 x 104 selil gliom U87 yo te simen nan plak 96-byen epi melanje ak exosomes ki enfekte ak Toxoplasma ki sòti nan BV2 (50 μg/mL) oswa exosomes nonpulse ki sòti nan BV2 (50 μg/mL) kòm kontwòl nan 12, 18 ak 36 èdtan. .Yo te detèmine pousantaj pwopagasyon selil yo lè l sèvi avèk Twous Konte Selil-8 (Dojindo, Kumamoto, Japon) (Figi Siplemantè S1-S3) 46 .
5-semèn sourit fi BALB/c toutouni yo te achte nan men Orient Bio (Seongnam-si, Kore di Sid) epi yo te kenbe endividyèlman nan kaj esteril nan tanperati chanm (22±2 °C) ak imidite (45±15 °C).%) nan tanperati chanm (22±2 °C) ak imidite (45±15%).Yo te fè yon sik limyè 12 èdtan ak yon sik nwa 12 èdtan anba SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Sourit yo te owaza divize an twa gwoup 5 sourit chak ak tout gwoup yo te enjekte anba lar ak 400 ml PBS ki gen 1 x 107 selil gliom U87 ak faktè kwasans redwi BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, USA).Sis jou apre piki timè, yo te enjekte 200 mg exosomes ki soti nan selil BV2 (avèk/san enfeksyon Toxoplasma) nan sit timè a.Vennde jou apre enfeksyon timè, gwosè timè sourit nan chak gwoup te mezire ak yon kalib twa fwa pa semèn, epi volim timè a te kalkile pa fòmil la: 0.5 × (lajè) × 2 × longè.
Analiz ekspresyon MicroRNA lè l sèvi avèk miRCURYTM LNA miRNA etalaj, 7yèm jenerasyon gen, mmu ak rno etalaj (EXIQON, Vedbaek, Denmark) ki kouvri 1119 sourit byen karakterize nan mitan 3100 moun, sourit ak rat miRNA kaptire sond.Pandan pwosedi sa a, yo te retire 250 a 1000 ng nan RNA total nan 5′-fosfat la pa tretman ak ti bèf entesten fosfataz alkalin ki te swiv pa etikèt ak lank Hy3 vèt fliyoresan.Lè sa a, echantiyon ki make yo te ibride lè yo chaje glisad mikwo-array lè l sèvi avèk yon twous chanm ibridizasyon (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ak yon twous glisad ibridizasyon (Agilent Technologies).Ibridizasyon te pote soti pou 16 èdtan nan 56 ° C, Lè sa a, microarrays yo te lave an akò ak rekòmandasyon manifakti a.Lè sa a, yo te analize glisad mikwo-array trete yo lè l sèvi avèk yon sistèm eskanè mikwo-array Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Imaj analize yo te enpòte lè l sèvi avèk vèsyon lojisyèl Agilent Feature Extraction 10.7.3.1 (Agilent Technologies) epi yo te mezire entansite fliyoresans chak imaj lè l sèvi avèk dosye GAL korespondan pwotokòl Exiqon modifye.Done Microarray pou etid aktyèl la depoze nan baz done GEO anba nimewo asansyon GPL32397.
Yo te analize pwofil ekspresyon miRNA exosomal ki gen matirite nan microglia nan tansyon RH oswa ME49 ki enfekte ak Toxoplasma lè l sèvi avèk divès kalite zouti rezo.MiRNAs ki asosye ak devlopman timè yo te idantifye lè l sèvi avèk miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) epi filtre ak entansite siyal nòmalize (log2) ki pi gran pase 8.0.Pami miRNAs, yo te jwenn miRNAs diferan eksprime yo plis pase 1.5-pliye chanje pa analiz filtre miRNAs chanje pa tansyon RH oswa ME49 ki enfekte ak T. gondii.
Selil yo te simen nan plak sis-byen (3 x 105 selil / pi) nan opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) lè l sèvi avèk Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Selil transfekte yo te kiltive pou 6 èdtan epi Lè sa a, mwayen an te chanje nan mwayen fre konplè.Selil yo te rekòlte 24 èdtan apre transfeksyon.
Yo te fè analiz estatistik sitou lè l sèvi avèk T-tès Elèv la ak lojisyèl Excel (Microsoft, Washington, DC, USA).Pou analiz bèt eksperimantal, yo te fè yon ANOVA de-fason lè l sèvi avèk lojisyèl Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). P-valè <0.05 yo te konsidere kòm estatistik enpòtan. P-valè < 0.05 yo te konsidere kòm estatistik enpòtan. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Valè P <0.05 yo te konsidere kòm estatistik enpòtan. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P 值<0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Valè P <0.05 yo te konsidere kòm estatistik enpòtan.
Tout pwotokòl eksperimantal yo itilize nan etid sa a te apwouve pa Komisyon Konsèy Revizyon Enstitisyonèl Seoul National University School of Medicine (nimewo IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Estimasyon ensidans kansè mondyal ak mòtalite nan 2018: sous ak metòd GLOBOCAN.Entèpretasyon.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Yon insight sou faktè risk nan timè nan sèvo ak entèvansyon terapetik yo. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Yon insight sou faktè risk nan timè nan sèvo ak entèvansyon terapetik yo.Rashid, S., Rehman, K. ak Akash, MS Yon revizyon faktè risk pou timè nan sèvo ak pi gwo entèvansyon terapetik. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Konpreyansyon pwofon sou faktè risk timè nan sèvo ak entèvansyon terapetik.Rashid, S., Rehman, K. ak Akash, MS Yon revizyon faktè risk pou timè nan sèvo ak pi gwo entèvansyon terapetik.Syans byomedikal.Famasyen.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Solèy, J. Entèraksyon bakteri-viral nan kansè owodijestif imen ak kansè nan aparèy jenital fi: Yon rezime prèv epidemyolojik ak laboratwa. Kato, I., Zhang, J. & Solèy, J. Entèraksyon bakteri-viral nan kansè owodijestif imen ak kansè nan aparèy jenital fi: Yon rezime prèv epidemyolojik ak laboratwa.Kato I., Zhang J. ak Sun J. Entèraksyon bakteri-viral nan kansè nan aparèy gastwoentestinal imen an ak aparèy jenital fi: yon rezime done epidemyolojik ak laboratwa. Kato, I., Zhang, J. & Solèy, J. Kato, I., Zhang, J. & Solèy, J. Entèraksyon bakteri-viral nan dijesyon kavite oral imen ak aparèy repwodiktif fi: rezime syans maladi popilè ak prèv laboratwa.Kato I., Zhang J. ak Sun J. Entèraksyon bakteri-viral nan kansè gastwoentestinal imen ak kansè jenital fi: yon rezime done epidemyolojik ak laboratwa.Kansè 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Soti nan enfeksyon rive nan kansè: Ki jan viris timè ADN chanje metabolis kabòn santral ak lipid nan selil hôte. Magon, KL & Parish, JL Soti nan enfeksyon rive nan kansè: Ki jan viris timè ADN chanje metabolis kabòn santral ak lipid nan selil hôte.Mahon, KL ak Parish, JL Enfeksyon dife pou kansè: ki jan viris timè ki baze sou ADN chanje metabolis kabòn santral ak lipid selil lame yo. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质䣂谢 Magon, KL & Parish, JL Soti nan enfeksyon nan kansè: ki jan viris timè ADN chanje metabolis kabòn santral ak lipid selil lame yo.Mahon, KL ak Parish, JL Enfeksyon nan kansè: ki jan viris timè ADN chanje metabolis kabòn santral ak lipid nan selil lame yo.Louvri Biyoloji.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Estwojèn katekol nan schistosomes ak douz fwa ak kansè ki asosye ak helminth.devan.cho andedan.5, 444 (2014).