Mèsi paske w vizite Nature.com.Vèsyon navigatè w ap itilize a gen sipò CSS limite.Pou pi bon eksperyans, nou rekòmande pou w sèvi ak yon navigatè ki ajou (oswa enfim mòd konpatibilite nan Internet Explorer).Antretan, pou asire sipò kontinye, nou pral rann sit la san estil ak JavaScript.
Vektè jèn pou tretman fibwoz sistik poumon yo dwe vize sou pasaj kondiktif yo, paske transdiksyon nan poumon periferik pa gen okenn efè terapetik.Efikasite transdiksyon viral gen rapò dirèkteman ak tan rezidans konpayi asirans lan.Sepandan, likid livrezon tankou transpòtè jèn natirèlman difize nan alveoli yo pandan rale, ak patikil ki ka geri nan nenpòt fòm yo rapidman retire pa transpò mucociliary.Pwolonje tan rezidans pòtè jèn yo nan aparèy respiratwa a enpòtan men li difisil pou reyalize.Pòtè-konjige patikil mayetik ki ka dirije nan sifas la nan aparèy respiratwa a ka amelyore vize rejyonal yo.Akòz pwoblèm ak nan D 'vivo, konpòtman an nan ti patikil mayetik sa yo sou sifas la Airway nan prezans yon jaden aplike mayetik mal konprann.Objektif etid sa a se te sèvi ak imaj synchrotron pou wè an vivo mouvman yon seri patikil mayetik nan trachea rat anestezi yo nan lòd yo etidye dinamik yo ak modèl konpòtman nan patikil sèl ak esansyèl nan vivo.Lè sa a, nou te evalye tou si livrezon nan patikil mayetik lentiviral nan prezans yon jaden mayetik ta ogmante efikasite nan transduction nan trachea rat la.Synchrotron X-ray D montre konpòtman an nan patikil mayetik nan estasyonè ak k ap deplase jaden mayetik nan vitro ak nan vivo.Patikil yo pa ka fasil trennen sou sifas pasaj k ap viv lè l sèvi avèk leman, men pandan transpò, depo yo konsantre nan jaden an de vi, kote chan mayetik la pi fò.Efikasite transdiksyon te ogmante tou sis fwa lè patikil mayetik lentiviral yo te delivre nan prezans yon jaden mayetik.Ansanm, rezilta sa yo sijere ke patikil mayetik lentiviral ak jaden mayetik yo ka apwòch ki gen anpil valè pou amelyore vize vektè jèn ak nivo transdiksyon nan pasaj kondiktif yo nan vivo.
Fibwoz sistik (CF) koze pa varyasyon nan yon jèn sèl ki rele CF transmembrane conductance regilatè (CFTR).Pwoteyin CFTR a se yon kanal ion ki prezan nan anpil selil epitelyal nan tout kò a, ki gen ladan pasaj lè yo, yon sit pi gwo nan patojèn fibwoz sistik.Defo nan CFTR mennen nan transpò dlo nòmal, dezidratasyon nan sifas Airway, ak diminye pwofondè kouch likid sifas Airway (ASL).Li tou afekte kapasite nan sistèm nan transpò mucociliary (MCT) pou netwaye pasaj yo nan patikil rale ak patojèn.Objektif nou se devlope yon terapi jèn lentiviral (LV) pou bay kopi kòrèk jèn CFTR ak amelyore ASL, MCT, ak sante nan poumon, epi kontinye devlope nouvo teknoloji ki ka mezire paramèt sa yo nan vivo1.
Vektè LV yo se youn nan kandida dirijan yo pou terapi jèn fibwoz sistik, sitou paske yo ka pèmanans entegre jèn ki ka geri a nan selil fondamantal Airway (selil souch Airway).Sa a enpòtan paske yo ka retabli idratasyon nòmal ak clearance larim lè yo diferansye nan selil sifas fonksyonèl ki korije jèn ki asosye ak fibwoz sistik, sa ki lakòz benefis dire tout lavi.Vektè LV yo dwe dirije kont pasaj kondiktif yo, paske sa a se kote patisipasyon poumon nan CF kòmanse.Livrezon vektè a pi fon nan poumon an ka lakòz transdiksyon alveolatè, men sa a pa gen okenn efè terapetik nan fibwoz sistik.Sepandan, likid tankou pòtè jèn natirèlman imigre nan alveoli yo lè yo respire apre akouchman3,4 ak patikil ki ka geri yo rapidman ekspilse nan kavite oral la pa MCTs.Efikasite transdiksyon LV gen rapò dirèkteman ak longè tan vektè a rete tou pre selil sib yo pou pèmèt absorption selilè - "tan rezidans" 5 ki fasilman vin pi kout pa koule lè tipik rejyonal yo ansanm ak absorption kowòdone nan larim ak patikil MCT.Pou fibwoz sistik, kapasite pou pwolonje tan rezidans LV nan pasaj yo enpòtan pou reyalize nivo transdiksyon wo nan zòn sa a, men li te difisil jiska prezan.
Pou simonte obstak sa a, nou pwopoze ke patikil mayetik LV (MP) ka ede nan de fason konplemantè.Premyèman, yo ka gide pa yon leman nan sifas Airway la pou amelyore vize epi ede patikil transpòtè jèn yo nan zòn ki dwat nan Airway la;ak ASL) deplase nan kouch selil 6. Deputy yo lajman itilize kòm veyikil livrezon dwòg vize lè yo mare nan antikò, dwòg chimyoterapi, oswa lòt molekil ki tache ak manbràn selilè oswa mare nan reseptè sifas selil yo ak akimile nan sit timè yo. prezans elektrisite estatik.Jaden mayetik pou terapi kansè 7. Lòt metòd "ipètermik" yo vize pou touye selil timè yo lè yo chofe Deputy yo lè yo ekspoze a chan mayetik osile.Prensip transfè mayetik, kote yo itilize yon jaden mayetik kòm yon ajan transfè pou amelyore transfè ADN nan selil yo, yo itilize souvan an vitro lè l sèvi avèk yon seri vektè jèn ki pa viral ak viral pou liy selil ki difisil pou transdui. ..Efikasite LV magnetotransfection ak livrezon LV MP in vitro nan yon liy selil epitelyal bwonch imen an prezans yon jaden mayetik estatik te etabli, ogmante efikasite transdiksyon pa 186 fwa konpare ak vektè LV pou kont li.LV MT te aplike tou nan yon modèl in vitro nan fibwoz sistik, kote transfèksyon mayetik ogmante transdiksyon LV nan kilti koòdone lè-likid pa yon faktè 20 nan prezans fibwoz sistik krache10.Sepandan, nan vivo ògàn magnetotransfection te resevwa relativman ti atansyon e sèlman te evalye nan kèk etid animal11,12,13,14,15, espesyalman nan poumon16,17.Sepandan, posiblite transfeksyon mayetik nan terapi nan poumon nan fibwoz sistik yo klè.Tan et al.(2020) te deklare ke "yon etid validation sou livrezon efikas nan poumon nan nanopartikil mayetik pral pave wout la pou pwochen estrateji CFTR pou rale amelyore rezilta klinik nan pasyan ki gen fibwoz sistik"6.
Konpòtman an nan ti patikil mayetik sou sifas la nan aparèy respiratwa a nan prezans yon jaden mayetik aplike se difisil a vizyalize ak etidye, ak Se poutèt sa yo mal konprann.Nan lòt etid, nou te devlope yon metòd Synchrotron pwopagasyon ki baze sou kontras X-Ray Imaging (PB-PCXI) pou D ki pa pwogrese ak quantification nan chanjman minit in vivo nan pwofondè ASL18 ak konpòtman MCT19,20 dirèkteman mezire hydrasyon sifas chanèl gaz. epi li itilize kòm yon endikatè bonè tretman efikasite.Anplis de sa, metòd nòt MCT nou an sèvi ak patikil dyamèt 10-35 µm ki konpoze de alumina oswa gwo vè endèks refraktif kòm makè MCT vizib ak PB-PCXI21.Tou de metòd yo apwopriye pou imaj yon seri kalite patikil, ki gen ladan Deputy.
Akòz rezolisyon espasyal ak tanporèl segondè, tès ASL ak MCT ki baze sou PB-PCXI nou yo byen adapte pou etidye dinamik ak modèl konpòtman patikil sèl ak esansyèl nan vivo pou ede nou konprann ak optimize metòd livrezon MP jèn yo.Apwòch nou itilize isit la baze sou etid nou yo lè l sèvi avèk liy limyè SPring-8 BL20B2 a, kote nou wè mouvman likid apre livrezon yon dòz yon vektè enbesil nan pasaj nen ak poumon sourit yo pou ede eksplike modèl ekspresyon jèn etewojèn nou yo obsève. nan jèn nou an.etid sou bèt ak yon dòz transpòtè 3.4.
Objektif etid sa a se te sèvi ak synchrotron PB-PCXI pou wè mouvman an vivo yon seri Deputy nan trachea rat vivan yo.Etid D 'PB-PCXI sa yo te fèt pou teste seri MP, fòs chan mayetik, ak kote pou detèmine efè yo sou mouvman MP.Nou te sipoze ke yon jaden mayetik ekstèn ta ede delivre MF rete oswa deplase nan zòn sib la.Etid sa yo tou pèmèt nou detèmine konfigirasyon leman ki maksimize kantite patikil ki rete nan trachea a apre depozisyon.Nan yon dezyèm seri etid, nou te vize pou sèvi ak konfigirasyon optimal sa a pou demontre modèl transdiksyon ki soti nan livrezon in vivo LV-MPs nan pasaj rat yo, sou sipozisyon ke livrezon LV-MPs nan yon kontèks vize Airway ta lakòz. nan ogmante efikasite transdiksyon LV..
Tout etid sou bèt yo te fèt an akò ak pwotokòl Inivèsite Adelaide (M-2019-060 ak M-2020-022) ak SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee te apwouve.Eksperyans yo te fèt an akò ak rekòmandasyon Arive.
Tout imaj radyografi yo te pran nan liy lan BL20XU nan synchrotron SPring-8 nan Japon lè l sèvi avèk yon konfigirasyon ki sanble ak sa ki dekri anvan21,22.Yon ti tan, bwat eksperimantal la te sitiye 245 m soti nan bag la depo synchrotron.Yo itilize yon distans echantiyon-a-detektè 0.6 m pou etid D 'patikil ak 0.3 m pou etid D in vivo pou kreye efè kontras faz.Yo te itilize yon gwo bout bwa monokrom ak yon enèji 25 keV.Imaj yo te akeri lè l sèvi avèk yon rezolisyon segondè transducer X-ray (SPring-8 BM3) makonnen ak yon detektè sCMOS.Transducer a konvèti radyografi nan limyè vizib lè l sèvi avèk yon scintillator 10 µm epè (Gd3Al2Ga3O12), ki Lè sa a, dirije nan Capteur sCMOS la lè l sèvi avèk yon objektif mikwoskòp ×10 (NA 0.3).Detektè sCMOS la se te yon Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japon) ak yon gwosè etalaj 2048 × 2048 piksèl ak yon gwosè pixel anvan tout koreksyon nan 6.5 × 6.5 µm.Anviwònman sa a bay yon gwosè pixel izotwòp efikas nan 0.51 µm ak yon jaden vizyon apeprè 1.1 mm × 1.1 mm.Dire ekspoze 100 ms te chwazi pou maksimize rapò siyal-bri nan patikil mayetik andedan ak deyò pasaj yo pandan y ap minimize zafè mouvman ki te koze pa respire.Pou etid in vivo yo, yo te mete yon vole rapid radyografi nan chemen radyografi pou limite dòz radyasyon an lè yo bloke reyon radyografi a ant ekspoze yo.
Medya LV yo pa te itilize nan okenn etid D 'SPring-8 PB-PCXI paske chanm D' BL20XU a pa sètifye Nivo Biosekirite 2.Olye de sa, nou te chwazi yon seri deputy ki byen karakterize nan de machann komèsyal ki kouvri yon seri gwosè, materyèl, konsantrasyon fè, ak aplikasyon pou, — premye yo nan lòd yo konprann ki jan chan mayetik afekte mouvman an nan Deputy nan kapilè vè, ak apre sa nan k ap viv pasaj lè yo.sifas.Gwosè MP a varye ant 0.25 ak 18 µm epi li fèt ak divès kalite materyèl (gade Tablo 1), men konpozisyon chak echantiyon, ki gen ladan gwosè patikil mayetik nan MP a, pa konnen.Dapre etid vaste MCT nou yo 19, 20, 21, 23, 24, nou espere ke MP ki rive jiska 5 µm ka wè sou sifas tracheal Airway la, pou egzanp, lè w retire ankadreman youn apre lòt pou wè amelyore vizibilite mouvman MP.Yon sèl MP de 0.25 µm pi piti pase rezolisyon aparèy imaj la, men PB-PCXI espere detekte kontras volumetrik yo ak mouvman likid sifas kote yo depoze apre yo fin depoze yo.
Echantiyon pou chak MP nan tablo a.1 te prepare nan 20 μl kapilè vè (Drummond Microcaps, PA, USA) ak yon dyamèt entèn 0.63 mm.Patikil corpusculaire yo disponib nan dlo, pandan y ap patikil CombiMag yo disponib nan likid pwopriyetè manifakti a.Chak tib ranpli mwatye ak likid (apeprè 11 µl) epi yo mete yo sou detantè echantiyon an (gade Figi 1).Kapilè vè yo te mete orizontal sou sèn nan nan chanm nan D, respektivman, epi yo te pozisyone nan bor yo nan likid la.Yon dyamèt 19 mm (28 mm longè) nikèl-koki leman ki fèt ak latè ra, neyodim, fè ak bor (NdFeB) (N35, cat. No LM1652, Jaycar Elektwonik, Ostrali) ak yon remanans 1.17 T te tache ak yon tab transfè separe pou reyalize Adistans chanje pozisyon ou pandan rann.X-ray D kòmanse lè leman an pozisyone apeprè 30 mm anlè echantiyon an epi imaj yo akeri nan 4 ankadreman pou chak segonn.Pandan D, yo te pote leman an tou pre tib kapilè an vè (nan yon distans apeprè 1 mm) ak Lè sa a, deplase sou tib la pou evalye efè a nan fòs jaden ak pozisyon.
Yon konfigirasyon D in vitro ki gen echantiyon MP nan kapilè vè nan etap tradiksyon echantiyon xy a.Chemen reyon radyografi a make ak yon liy pwenti wouj.
Yon fwa yo te etabli vizibilite in vitro nan Deputy yo, yo te teste yon ti gwoup nan yo an vivo sou rat albino Wistar fi (~ 12 semèn, ~ 200 g).Medetomidine 0.24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japon), midazolam 3.2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japon) ak butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Rat yo te anestezi ak melanj Pharma (Japon) pa piki intraperitoneal.Apre anestezi, yo te prepare pou imajine lè yo retire fouri ki ozalantou trachea a, mete yon tib andotracheal (ET; 16 Ga kanul venn, Terumo BCT), epi imobilize yo nan pozisyon an kouche sou yon plak imaj ki fèt sou koutim ki gen yon sak tèmik. pou kenbe tanperati kò a.22. Lè sa a, plak imaj la te tache ak etap echantiyon an nan bwat la imaj nan yon ti ang aliman trachea a orizontal sou imaj la radyografi jan yo montre nan Figi 2a.
(a) Enstalasyon D 'vivo nan inite D' SPring-8, chemen reyon X-ray make ak liy pwentiye wouj.(b, c) lokalizasyon leman tracheal te fè adistans lè l sèvi avèk de kamera IP orthogonally monte.Sou bò gòch nan imaj la sou ekran an, ou ka wè bouk la fil kenbe tèt la ak kanul livrezon enstale andedan tib la ET.
Yon sistèm ponp sereng kontwòl remote (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) ki itilize yon sereng vè 100 µl te konekte ak yon tib PE10 (0.61 mm OD, 0.28 mm ID) lè l sèvi avèk yon zegwi 30 Ga.Make tib la pou asire pwent la nan pozisyon ki kòrèk la nan trachea a lè w ap mete tib andotracheal la.Lè l sèvi avèk yon mikroponp, yo te retire piston sereng la epi yo te plonje pwent tib la nan echantiyon MP yo dwe delivre.Lè sa a, te antre nan tib la livrezon chaje nan tib andotracheal la, mete pwent an nan pati ki pi fò nan espere aplike jaden mayetik nou an.Akizisyon imaj yo te kontwole lè l sèvi avèk yon detektè souf ki konekte nan bwat distribisyon Arduino nou an, ak tout siyal (egzanp, tanperati, respirasyon, vole louvri/fèmen, ak akizisyon imaj) yo te anrejistre lè l sèvi avèk Powerlab ak LabChart (AD Instruments, Sydney, Ostrali) 22 Lè Imaging Lè lojman an pa t disponib, de kamera IP (Panasonic BB-SC382) te pozisyone nan apeprè 90 ° youn ak lòt epi yo te itilize pou kontwole pozisyon leman an parapò ak trachea a pandan D (Figi 2b, c).Pou minimize zafè mouvman, yo te jwenn yon imaj pou chak souf pandan plato tèminal koule respiratwa a.
Se leman an tache ak dezyèm etap la, ki ka lokalize adistans sou deyò kò a D '.Yo te teste plizyè pozisyon ak konfigirasyon leman an, tankou: mete nan yon ang apeprè 30° pi wo pase trachea a (konfigirasyon yo montre nan Figi 2a ak 3a);yon leman anlè bèt la ak lòt la anba a, ak poto yo mete pou atraksyon (Figi 3b)., yon leman anlè bèt la ak youn anba a, ak poto yo mete pou repouse (Figi 3c), ak yon leman anlè ak pèpandikilè ak trachea a (Figi 3d).Apre mete bèt la ak leman epi chaje MP anba tès la nan ponp sereng la, bay yon dòz 50 µl nan yon pousantaj de 4 µl/sec lè w jwenn imaj yo.Lè sa a, leman an deplase retounen ak lide ansanm oswa atravè trachea a pandan y ap kontinye jwenn imaj.
Konfigirasyon leman pou D in vivo (a) yon sèl leman anlè trachea a nan yon ang apeprè 30°, (b) de leman configuré pou atraksyon, (c) de leman configuré pou repouse, (d) yon leman pi wo a ak pèpandikilè a. trachea.Obsèvatè a gade desann soti nan bouch la nan poumon yo atravè trachea a ak reyon radyografi a te pase nan bò gòch nan rat la ak sòti bò dwat la.Se leman an swa deplase sou longè Airway la oswa goch ak dwa anlè trachea a nan direksyon reyon radyografi a.
Nou t ap chèche tou pou detèmine vizibilite ak konpòtman patikil yo nan pasaj lè yo pa melanje respirasyon ak batman kè.Se poutèt sa, nan fen peryòd D ', bèt yo te imanite euthanized akòz surdozaj pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~ 65 mg / kg ip).Gen kèk bèt ki rete sou platfòm D' a, epi apre yo fin sispann respire ak batman kè, pwosesis D la te repete, ajoute yon dòz adisyonèl MP si pa gen MP vizib sou sifas Airway la.
Imaj ki te lakòz yo te korije pou jaden plat ak nwa epi yo te rasanble nan yon fim (20 ankadreman pou chak segonn; 15–25 × vitès nòmal depann sou to respirasyon) lè l sèvi avèk yon script koutim ekri nan MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Tout etid sou livrezon vektè LV jèn yo te fèt nan University of Adelaide Laboratory Animal Research Center ak vize pou sèvi ak rezilta eksperyans SPring-8 pou evalye si livrezon LV-MP nan prezans yon jaden mayetik ta ka amelyore transfè jèn nan vivo. .Pou evalye efè MF ak chan mayetik, de gwoup bèt yo te trete: yon gwoup te sou fòm piki ak LV MF ak plasman leman, ak lòt gwoup la te sou fòm piki ak yon gwoup kontwòl ak LV MF san leman.
Vektè jèn LV yo te pwodwi lè l sèvi avèk metòd ki dekri deja 25, 26.Vektè LacZ la eksprime yon jèn beta-galactosidase lokalize nikleyè kondwi pa pwomotè konstititif MPSV (LV-LacZ), ki pwodui yon pwodwi reyaksyon ble nan selil transdui, vizib sou fwon ak seksyon tisi nan poumon.Titrasyon te fèt nan kilti selil yo pa manyèlman konte kantite selil LacZ-pozitif lè l sèvi avèk yon emocytometer pou kalkile tit la nan TU / ml.Pòtè yo kriyokonsève nan -80 °C, dekonjle anvan yo itilize, epi yo mare nan CombiMag lè yo melanje 1:1 ak enkubasyon sou glas pou omwen 30 minit anvan livrezon.
Nòmal Sprague Dawley rat (n = 3 / gwoup, ~ 2-3 anestezi ip ak yon melanj de 0.4mg / kg medetomidine (Domitor, Ilium, Ostrali) ak 60mg / kg ketamin (Ilium, Ostrali) nan 1 mwa ki gen laj) ip ) piki ak canulation oral ki pa chirijikal ak yon kanul venn 16 Ga.Pou asire ke tisi tracheal Airway resevwa transduction LV, li te kondisyone lè l sèvi avèk pwotokòl perturbation mekanik nou an ki te dekri deja nan ki sifas tracheal Airway yo te fwote axial ak yon panyen fil (N-Circle, nitinol wòch ekstrè san pwent NTSE-022115) -UDH , Cook Medical, USA) 30 p28.Lè sa a, apeprè 10 minit apre perturbation nan kabinè biosekirite a, yo te fè administrasyon tracheal LV-MP.
Te chan mayetik yo itilize nan eksperyans sa a konfigirasyon menm jan ak yon etid radyografi in vivo, ak leman yo menm ki te kenbe sou trachea a ak kranpon stent distilasyon (Figi 4).Yon volim 50 µl (2 x 25 µl aliquot) nan LV-MP te delivre nan trachea a (n = 3 bèt) lè l sèvi avèk yon pipèt jèl-pwent jan sa dekri anvan.Gwoup kontwòl la (n = 3 bèt) te resevwa menm LV-MP san yo pa itilize yon leman.Apre perfusion la fini, yo retire kanul la nan tib andotracheal la epi yo retire bèt la.Eman an rete an plas pou 10 minit anvan yo retire li.Rat yo te dòz anba lar ak meloxicam (1 ml / kg) (Ilium, Ostrali) ki te swiv pa retrè anestezi pa piki intraperitoneal nan 1 mg / kg atipamazole idroklorid (Antisedan, Zoetis, Ostrali).Rat yo te kenbe cho ak obsève jiskaske rekiperasyon konplè nan anestezi.
Aparèy livrezon LV-MP nan yon kabinè sekirite byolojik.Ou ka wè manch limyè gri Luer-lock nan tib ET a soti nan bouch la, epi pwent pipèt jèl yo montre nan figi a antre nan tib ET a nan pwofondè a vle nan trachea a.
Yon semèn apre pwosedi administrasyon LV-MP, bèt yo te sakrifye imen pa rale 100% CO2 ak ekspresyon LacZ te evalye lè l sèvi avèk tretman X-gal estanda nou an.Yo te retire twa bag Cartilage ki pi caudal yo pou asire ke nenpòt domaj mekanik oswa retansyon likid akòz plasman tib andotracheal pa ta enkli nan analiz la.Chak trachea te koupe longè pou jwenn de mwatye pou analiz epi yo mete yo nan yon tas ki gen kawotchou silikon (Sylgard, Dow Inc) lè l sèvi avèk yon zegwi Minutien (Fine Science Tools) pou visualiser sifas luminal la.Distribisyon ak karaktè nan selil transduced yo te konfime pa fotografi frontal lè l sèvi avèk yon mikwoskòp Nikon (SMZ1500) ak yon kamera DigiLite ak lojisyèl TCapture (Tucsen Photonics, Lachin).Imaj yo te akeri nan agrandisman 20x (ki gen ladan anviwònman maksimòm pou tout lajè trachea a), ak tout longè trachea a parèt etap pa etap, bay ase sipèpoze ant chak imaj pou pèmèt imaj yo dwe "koud".Imaj yo soti nan chak trachea yo te Lè sa a, konbine nan yon imaj konpoze sèl lè l sèvi avèk Composite Image Editor vèsyon 2.0.3 (Microsoft Research) lè l sèvi avèk algorithm mouvman planar. Sipèfisi ekspresyon LacZ nan imaj konpoze tracheal chak bèt yo te mezire lè l sèvi avèk yon script MATLAB otomatik (R2020a, MathWorks) jan sa te dekri anvan28, lè l sèvi avèk anviwònman 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, ak Valè < 0.7. Yo te mezire zòn ekspresyon LacZ nan imaj konpoze tracheal yo nan chak bèt lè l sèvi avèk yon script MATLAB otomatik (R2020a, MathWorks) jan sa te dekri deja28, lè l sèvi avèk anviwònman 0.35 < Hue < 0.58, saturation > 0.15, ak valè < 0.7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Yo te mezire zòn nan ekspresyon LacZ nan imaj tracheal konpoze ki soti nan chak bèt lè l sèvi avèk yon script MATLAB otomatik (R2020a, MathWorks) jan sa te dekri deja28 lè l sèvi avèk anviwònman 0.35.0.15 ak valè <0.7.如 前所 述 ， 自动 Matlab 脚本 （R2020A ， Mathworks） 对 来自 只 动物 的 气管 复合 图像 中 的 LACZ如 前所 述 自动 自动 Matlab 脚本 （（R2020A ， Mathworks） 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 HIP Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Zòn ekspresyon LacZ sou imaj konpoze trachea chak bèt yo te mezire lè l sèvi avèk yon script MATLAB otomatik (R2020a, MathWorks) jan sa te dekri deja lè l sèvi avèk anviwònman 0.35 < Hue < 0.58, saturation > 0.15 ak valè < 0.7 .Lè w swiv kontou tisi yo nan GIMP v2.10.24, yo te kreye yon mask manyèlman pou chak imaj konpoze pou idantifye zòn tisi a epi anpeche nenpòt deteksyon fo deyò tisi tracheal la.Yo te fè adisyone zòn tache ki soti nan tout imaj konpoze chak bèt pou bay total zòn tache pou bèt sa a.Lè sa a, zòn ki pentire a divize pa zòn total mask la pou jwenn yon zòn nòmalize.
Chak trachea te entegre nan parafine ak seksyon 5 µm epè.Seksyon yo te counterstained ak net vit wouj pou 5 minit ak imaj yo te akeri lè l sèvi avèk yon mikwoskòp Nikon Eclipse E400, kamera DS-Fi3 ak lojisyèl kaptire eleman NIS (vèsyon 5.20.00).
Tout analiz estatistik yo te fèt nan GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Siyifikasyon estatistik te fikse nan p ≤ 0.05.Yo te teste nòmalman lè l sèvi avèk tès Shapiro-Wilk ak diferans ki genyen nan tach LacZ yo te evalye lè l sèvi avèk yon tès t ki pa pè.
PCXI te egzamine sis Deputy ki dekri nan Tablo 1, epi vizibilite a dekri nan Tablo 2. De MP1 ak MP2 polistirèn (MP1 ak MP2; 18 µm ak 0.25 µm, respektivman) pa t vizib pa PCXI, men echantiyon ki rete yo te kapab idantifye. (egzanp yo montre nan Figi 5).MP3 ak MP4 yo fèb vizib (10-15% Fe3O4; 0.25 µm ak 0.9 µm, respektivman).Malgre ke MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) te genyen kèk nan pi piti patikil yo teste, li te pi pwononse.Pwodwi CombiMag MP6 a difisil pou distenge.Nan tout ka yo, kapasite nou pou detekte MF yo te amelyore anpil lè nou deplase leman an retounen ak lide paralèl ak kapilè a.Kòm leman yo te deplase lwen kapilè a, patikil yo te rale soti nan chèn long, men kòm leman yo te pwoche ak fòs nan jaden mayetik ogmante, chèn patikil yo pi kout kòm patikil yo te imigre nan direksyon anwo sifas kapilè a (gade Videyo Siplemantè S1). : MP4), ogmante dansite patikil nan sifas la.Kontrèman, lè yo retire leman an nan kapilè a, fòs jaden an diminye epi Deputy yo reyranje nan chenn long ki pwolonje soti nan sifas la anwo nan kapilè a (al gade Videyo Siplemantè S2: MP4).Apre leman an sispann deplase, patikil yo kontinye deplase pou kèk tan apre yo fin rive nan pozisyon ekilib la.Kòm MP a deplase nan direksyon ak lwen sifas anwo a nan kapilè a, patikil yo mayetik yo gen tandans trase debri nan likid la.
Vizibilite MP anba PCXI varye konsiderableman ant echantiyon.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ak (d) MP6.Tout imaj yo montre isit la yo te pran ak yon leman pozisyone apeprè 10 mm dirèkteman anlè kapilè a.Gwo ti sèk aparan yo se bul lè bloke nan kapilè yo, ki montre klèman karakteristik kwen nwa ak blan imaj kontras faz la.Bwat wouj la endike agrandisman ki amelyore kontras la.Remake byen ke dyamèt sikui leman yo nan tout figi yo pa echèl epi yo apeprè 100 fwa pi gwo pase yo montre.
Pandan leman an ap deplase agòch ak adwat sou tèt kapilè a, ang fisèl MP la chanje pou aliman ak leman an (gade Figi 6), konsa delimite liy chan mayetik yo.Pou MP3-5, apre kòd la rive nan ang papòt la, patikil yo trennen sou sifas anwo a nan kapilè a.Sa a souvan lakòz Deputy rasanble nan pi gwo gwoup toupre kote jaden mayetik la pi fò (gade Videyo Siplemantè S3: MP5).Sa a se tou espesyalman evidan lè D 'tou pre nan fen kapilè a, ki lakòz MP a total ak konsantre nan koòdone nan likid-lè.Patikil yo nan MP6 a, ki te pi difisil yo distenge pase sa yo ki nan MP3-5 a, pa t 'trennen lè leman an te deplase sou kapilè a, men fisèl MP yo disosye, kite patikil yo nan vi (gade Videyo Siplemantè S4: MP6).Nan kèk ka, lè yo te aplike jaden mayetik la redwi pa deplase leman an yon distans ki long soti nan sit la D ', nenpòt ki Deputy ki rete tou dousman desann nan sifas la anba nan tib la pa gravite, ki rete nan fisèl la (al gade Videyo Siplemantè S5: MP3) .
Ang fisèl MP a chanje pandan leman an ap deplase sou bò dwat anwo kapilè a.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ak (d) MP6.Bwat wouj la endike agrandisman ki amelyore kontras la.Tanpri sonje ke videyo adisyonèl yo se pou rezon enfòmasyon paske yo revele estrikti patikil enpòtan ak enfòmasyon dinamik ki pa ka vizyalize nan imaj estatik sa yo.
Tès nou yo te montre ke deplase leman an retounen ak lide tou dousman sou trachea a fasilite vizyalizasyon MF a nan yon kontèks mouvman konplèks nan vivo.Pa gen okenn tès in vivo yo te fèt paske pèl yo polystyrène (MP1 ak MP2) pa t 'vizib nan kapilè a.Chak nan kat MF ki rete yo te teste an vivo ak aks long nan leman an pozisyone sou trachea a nan yon ang apeprè 30 ° nan vètikal la (gade figi 2b ak 3a), paske sa a te lakòz chenn MF ki pi long e li te pi efikas. pase yon leman..konfigirasyon sispann.MP3, MP4 ak MP6 pa te jwenn nan trachea nenpòt bèt vivan.Lè w wè aparèy respiratwa rat yo apre yo fin touye bèt yo, patikil yo te rete envizib menm lè yo te ajoute plis volim lè l sèvi avèk yon ponp sereng.MP5 te gen pi gwo kontni an oksid fè e li te sèlman patikil vizib la, kidonk li te itilize pou evalye ak karakterize konpòtman MP nan vivo.
Plasman nan leman an sou trachea a pandan ensèsyon MF te lakòz anpil, men se pa tout, MF yo te konsantre nan jaden an de vi.Antre tracheal nan patikil yo pi byen obsève nan bèt limanize yo.Figi 7 ak Videyo Siplemantè S6: MP5 montre rapid mayetik kaptire ak aliyman nan patikil sou sifas trachea ventral la, ki endike ke MP yo ka vize nan zòn vle nan trachea a.Lè w ap chèche plis distal sou trachea a apre livrezon MF, gen kèk MF yo te jwenn pi pre carina a, ki endike ensifizan fòs chan mayetik pou kolekte epi kenbe tout MF, paske yo te delivre nan rejyon an nan fòs maksimòm chan mayetik pandan administrasyon likid.pwosesis.Sepandan, konsantrasyon MP apre akouchman yo te pi wo alantou zòn imaj la, ki sijere ke anpil Deputy te rete nan rejyon Airway kote fòs chan mayetik aplike a te pi wo.
Imaj nan (a) anvan ak (b) apre livrezon MP5 nan trachea a nan yon rat ki fèk euthanize ak yon leman mete jis anlè zòn nan imaj.Zòn ki reprezante a sitiye ant de bag cartilaginous.Gen kèk likid nan pasaj yo anvan MP a delivre.Bwat wouj la endike agrandisman ki amelyore kontras la.Yo pran imaj sa yo nan videyo ki parèt nan S6: MP5 Supplementary Video.
Deplase leman an sou trachea a nan vivo te lakòz yon chanjman nan ang chèn MP sou sifas Airway la, menm jan ak sa yo obsève nan kapilè (gade Figi 8 ak Videyo Siplemantè S7: MP5).Sepandan, nan etid nou an, Deputy pa t 'kapab trennen sou sifas la nan aparèy respiratwa k ap viv, tankou kapilè te kapab fè.Nan kèk ka, chèn MP a alonje kòm leman an deplase goch ak dwa.Enteresan, nou menm tou nou te jwenn ke chèn patikil la chanje pwofondè kouch sifas likid la lè leman an deplase longitudinal sou trachea a, epi li elaji lè leman an deplase dirèkteman anlè epi chèn patikil la vire nan yon pozisyon vètikal (gade. Videyo Siplemantè S7).: MP5 a 0:09, anba adwat).Modèl mouvman karakteristik yo te chanje lè leman an te deplase lateralman sou tèt trachea a (sa vle di, sou bò gòch oswa sou bò dwat bèt la, olye ke sou longè trachea a).Patikil yo te toujou klèman vizib pandan mouvman yo, men lè yo te retire leman an nan trachea a, pwent fisèl patikil yo te vin vizib (gade Videyo Siplemantè S8: MP5, kòmanse nan 0:08).Sa a dakò ak konpòtman an obsève nan jaden an mayetik anba aksyon an nan yon jaden aplike mayetik nan yon kapilè vè.
Egzanp imaj ki montre MP5 nan trachea yon rat vivan anestezi.(a) Leman an itilize pou jwenn imaj pi wo a ak sou bò gòch trachea a, epi (b) apre yo fin deplase leman an sou bò dwat la.Bwat wouj la endike agrandisman ki amelyore kontras la.Imaj sa yo soti nan videyo ki parèt nan Videyo Siplemantè S7 la: MP5.
Lè de poto yo te branche nan yon oryantasyon nò-sid pi wo a ak anba trachea a (sa vle di, atire; Fig. 3b), kòd MP yo te parèt pi long epi yo te lokalize sou miray lateral trachea a olye ke sou sifas dorsal la. trachea (gade Apendis).Videyo S9:MP5).Sepandan, gwo konsantrasyon patikil nan yon sèl sit (sa vle di, sifas dorsal trachea a) pa te detekte apre administrasyon likid lè l sèvi avèk yon aparèy leman doub, ki anjeneral rive ak yon aparèy leman sèl.Lè sa a, lè yon sèl leman te configuré pou repouse poto opoze (Figi 3c), kantite patikil ki vizib nan jaden an pa te ogmante apre livrezon.Mete kanpe tou de de konfigirasyon leman se defi akòz gwo fòs nan jaden mayetik ki atire oswa pouse leman yo respektivman.Lè sa a, konfigirasyon an te chanje nan yon sèl leman paralèl ak pasaj yo men pase nan pasaj yo nan yon ang 90 degre pou ke liy fòs yo travèse miray la tracheal orthogonally (Figi 3d), yon oryantasyon ki gen entansyon detèmine posibilite pou agrégation patikil sou. miray lateral la.dwe obsève.Sepandan, nan konfigirasyon sa a, pa te gen okenn mouvman akimilasyon MF ki idantifye oswa mouvman leman.Ki baze sou tout rezilta sa yo, yo te chwazi yon konfigirasyon ak yon leman sèl ak yon oryantasyon 30 degre pou etid in vivo nan transpòtè jèn (Fig. 3a).
Lè bèt la te imajine plizyè fwa imedyatman apre yo te sakrifye imen an, absans la nan mouvman tisi entèfere te vle di ke pi rafine, liy patikil ki pi kout yo te kapab disène nan jaden an klè entèkartilaj, 'balanse' an akò ak mouvman an tradiksyon nan leman an.klèman wè prezans ak mouvman nan patikil MP6.
Tit LV-LacZ te 1.8 x 108 IU/mL, epi apre yo fin melanje 1:1 ak CombiMag MP (MP6), bèt yo te sou fòm piki ak 50 µl nan yon dòz tracheal 9 x 107 IU/ml nan machin LV (sa vle di 4.5). x 106 TU/rat).).).Nan etid sa yo, olye pou yo deplase leman an pandan travay la, nou fikse leman an nan yon pozisyon pou detèmine si transdiksyon LV ta ka (a) amelyore konpare ak livrezon vektè nan absans yon jaden mayetik, ak (b) si Airway a te kapab. dwe konsantre.Selil yo te transduce nan zòn sib mayetik nan aparèy respiratwa anwo a.
Prezans leman ak itilizasyon CombiMag an konbinezon ak vektè LV pa t parèt pou yon move efè sou sante bèt, menm jan ak pwotokòl livrezon vektè LV estanda nou an.Imaj Frontal nan rejyon tracheal la sibi perturbasyon mekanik (figi siplemantè 1) te montre ke gwoup la trete LV-MP te gen nivo siyifikativman pi wo nan transdiksyon nan prezans yon leman (figi 9a).Sèlman yon ti kantite tach ble LacZ te prezan nan gwoup kontwòl la (Figi 9b).Kantifikasyon nan rejyon normalize X-Gal-tache te montre ke administrasyon LV-MP nan prezans yon jaden mayetik te lakòz yon amelyorasyon apeprè 6-pliye (figi 9c).
Egzanp imaj konpoze ki montre transdiksyon tracheal ak LV-MP (a) nan prezans yon jaden mayetik ak (b) nan absans yon leman.(c) Amelyorasyon estatistik siyifikatif nan zòn nòmal transdiksyon LacZ nan trachea a ak itilizasyon yon leman (*p = 0.029, t-tès, n = 3 pou chak gwoup, vle di ± erè estanda nan mwayèn).
Seksyon net vit wouj-tache (egzanp yo montre nan Fig. 2 siplemantè) endike ke selil LacZ-tache yo te prezan nan menm echantiyon an ak nan menm kote a jan yo te rapòte deja.
Kle defi a nan terapi jèn Airway rete lokalizasyon egzak patikil konpayi asirans nan zòn ki enterese yo ak reyalizasyon yon wo nivo efikasite transdiksyon nan poumon mobil nan prezans koule lè ak clearance larim aktif.Pou transpòtè LV ki gen entansyon pou tretman maladi respiratwa nan fibwoz sistik, ogmante tan rezidans patikil yo nan pasaj kondiktif yo se te yon objektif ki pa ka atenn.Kòm vize pa Castellani et al., Itilizasyon chan mayetik amelyore transdiksyon gen avantaj sou lòt metòd livrezon jèn tankou elektwoporasyon paske li ka konbine senplisite, ekonomi, livrezon lokalize, ogmante efikasite, ak pi kout tan enkubasyon.epi pètèt yon dòz pi ba nan machin10.Sepandan, nan depo in vivo ak konpòtman nan patikil mayetik nan pasaj yo anba enfliyans nan fòs ekstèn mayetik pa janm te dekri, e an reyalite kapasite nan metòd sa a ogmante nivo ekspresyon jèn nan pasaj ki vivan entak pa te demontre nan vivo.
Eksperyans in vitro nou yo sou PCXI synchrotron te montre ke tout patikil nou teste yo, eksepte polystyrène MP, te vizib nan konfigirasyon D nou te itilize a.Nan prezans yon jaden mayetik, jaden mayetik fòme fisèl, longè ki gen rapò ak kalite patikil ak fòs nan jaden mayetik (sa vle di, pwoksimite a ak mouvman nan leman an).Jan yo montre nan Figi 10, fisèl nou obsève yo fòme kòm chak patikil endividyèl vin magnetize epi pwovoke pwòp chan mayetik lokal li yo.Jaden separe sa yo lakòz lòt patikil ki sanble yo kolekte epi konekte ak mouvman fisèl gwoup akòz fòs lokal yo soti nan fòs lokal yo nan atraksyon ak repouse lòt patikil.
Dyagram ki montre (a, b) chenn patikil k ap fòme andedan kapilè ki ranpli ak likid epi (c, d) yon trachea ki plen lè.Remake byen ke kapilè yo ak trachea yo pa trase nan echèl la.Panèl (a) gen ladan tou yon deskripsyon MF a ki gen patikil Fe3O4 ranje nan chenn.
Lè leman an deplase sou kapilè a, ang fisèl patikil la rive nan papòt kritik pou MP3-5 ki gen Fe3O4, apre sa fisèl patikil la pa rete nan pozisyon orijinal li, men li deplase sou sifas la nan yon nouvo pozisyon.leman.Efè sa a gen anpil chans rive paske sifas kapilè an vè lis ase pou pèmèt mouvman sa a rive.Enteresan, MP6 (CombiMag) pa t 'konpòte fason sa a, petèt paske patikil yo te pi piti, te gen yon kouch diferan oswa chaj sifas, oswa likid la konpayi asirans propriétaire afekte kapasite yo pou avanse pou pi.Kontras la nan imaj la patikil CombiMag se tou pi fèb, sijere ke likid la ak patikil yo ka gen menm dansite ak Se poutèt sa pa ka fasil deplase youn nan direksyon lòt.Patikil yo ka kole tou si leman an deplase twò vit, sa ki endike ke fòs nan jaden mayetik pa ka toujou simonte friksyon ki genyen ant patikil nan likid la, sijere ke fòs nan jaden mayetik ak distans ki genyen ant leman an ak zòn nan sib pa ta dwe vini kòm yon sipriz.enpòtan.Rezilta sa yo tou endike ke byenke leman ka pran anpil mikwopartikil k ap koule nan zòn sib la, li pa posib ke leman yo ka konte sou yo deplase patikil CombiMag sou sifas la nan trachea a.Kidonk, nou konkli ke etid LV MF nan vivo yo ta dwe itilize jaden mayetik estatik pou vize fizikman zòn espesifik nan pye bwa a Airway.
Yon fwa patikil yo lage nan kò a, yo difisil pou idantifye nan yon kontèks tisi k ap deplase konplèks nan kò a, men kapasite deteksyon yo te amelyore lè yo deplase leman an orizontal sou trachea a pou "mennen" fisèl MP yo.Pandan ke imaj an tan reyèl posib, li pi fasil yo disène mouvman patikil apre bèt la te touye imen.Konsantrasyon MP yo te anjeneral pi wo nan kote sa a lè leman an te pozisyone sou zòn nan D, byenke kèk patikil yo te anjeneral jwenn pi lwen desann trachea a.Kontrèman ak etid in vitro, patikil yo pa ka trennen desann trachea a pa mouvman an nan yon leman.Konklizyon sa a konsistan avèk fason larim ki kouvri sifas trachea a anjeneral trete patikil ki respire yo, pyèj yo nan larim la epi imedyatman netwaye yo atravè mekanis clearance muco-ciliary.
Nou te ipotèz ke lè l sèvi avèk leman pi wo a ak anba trachea a pou atraksyon (Fig. 3b) ta ka lakòz yon jaden mayetik ki pi inifòm, olye ke yon jaden mayetik ki trè konsantre nan yon pwen, potansyèlman sa ki lakòz yon distribisyon plis inifòm nan patikil..Sepandan, etid preliminè nou an pa t jwenn prèv klè pou sipòte ipotèz sa a.Menm jan an tou, mete yon pè leman pou repouse (figi 3c) pa t 'gen rezilta nan plis patikil rezoud nan zòn nan imaj.De konklizyon sa yo demontre ke konfigirasyon doub-eman an pa amelyore siyifikativman kontwòl lokal MP montre, e ke fòs mayetik fò yo ki kapab lakòz yo difisil a melodi, fè apwòch sa a mwens pratik.Menm jan an tou, oryante leman an pi wo a ak atravè trachea a (Figi 3d) tou pa t ogmante kantite patikil ki rete nan zòn imaj la.Kèk nan konfigirasyon altènatif sa yo ka pa reyisi paske yo lakòz yon rediksyon nan fòs chan mayetik nan zòn depozisyon an.Kidonk, konfigirasyon leman sèl la nan 30 degre (figi 3a) konsidere kòm metòd tès in vivo ki pi senp ak pi efikas.
Etid LV-MP la te montre ke lè vektè LV yo te konbine avèk CombiMag epi yo te delivre apre yo te deranje fizikman an prezans yon chan mayetik, nivo transdiksyon ogmante siyifikativman nan trachea a konpare ak kontwòl yo.Ki baze sou etid D 'synchrotron ak rezilta LacZ, jaden mayetik la te parèt pou kapab kenbe LV a nan trachea a epi redwi kantite patikil vektè ki imedyatman antre byen fon nan poumon an.Amelyorasyon vize sa yo ka mennen nan pi wo efikasite pandan y ap diminye tit ki delivre yo, transdiksyon ki pa vize, efè segondè enflamatwa ak iminitè, ak depans transfè jèn yo.Sa ki enpòtan, dapre manifakti a, CombiMag ka itilize nan konbinezon ak lòt metòd transfè jèn, ki gen ladan lòt vektè viral (tankou AAV) ak asid nikleyik.